伤口愈合是一项复杂且高度协调的生物修复活动,主要包含止血期、炎症期、增殖期和重塑期等阶段。在遭受创伤后,皮肤完整性遭到破坏,导致血液流失和局部炎症,环境污染物容易造成感染,延迟愈合,留下瘢痕,这给患者的身心健康带来严重的影响。我国每年遭受皮肤创伤人数超过1 000万,研制新的促创伤愈合且预防异常瘢痕形成制剂具有很高的临床应用价值。方格星虫(Sipunculus nudus),营养丰富,味道鲜甜。主要用于鲜销和加工成干制品,近几年其深加工价值越来越受到重视,活性研究和应用也日益广泛。现代医学研究表明其具有抗氧化、抗疲劳、抗病毒、调节免疫、抗菌、抗炎和外周镇痛等功效,其中免疫调节、抗菌和抗炎功效与伤口愈合密切相关。同时其精氨酸含量极高,具有促进愈合功能。又有研究表明可口革囊星虫胶原蛋白可促进皮肤创伤修复,同属星虫动物门的方格星虫也可能有相似功效。本文以方格星虫为原料,从创伤愈合的不同阶段探讨其功效与作用机制,为开发成相关制剂提供理论依据,研究内容如下:(1)通过酶法制备方格星虫全肉酶解物(SNH),建立小鼠皮肤创伤模型,以涂抹和灌胃给药两种方式评价SNH促愈合活性。相比于空白对照组(NT),涂抹SNH显著缩短出血时间、提高伤口愈合率,第7 d,抑制IL-1β、TNF-α和TGF-β1分泌,第14 d显著提高羟脯胺酸含量,结果表明涂抹SNH具有促进愈合的作用,灌胃SNH无明显作用。因而,本研究采用涂抹给药的方式进一步研究。(2)为了筛选出最佳促愈合组分和探究促愈合机制,采用酸酶结合法提取方格星虫胶原蛋白(SNC),以动物蛋白酶和风味酶酶解制备方格星虫胶原肽(SNCP),热水提取法制备方格星虫水提物(SNE),建立小鼠创伤模型,以伤口愈合率、组织病理学、实时荧光定量PCR和透射电镜(TEM)等指标评价SNCP、SNE和SNH的促愈合及抗瘢痕作用。SNCP、SNE和SNH在止血、伤口愈合率、掉痂时间、抗炎、表皮重塑、促进胶原的生成和重塑、调节病理性瘢痕相关的细胞因子和胶原纤维的直径分布等各方面显著优于NT组。结果表明三者均具有促进愈合和抑制瘢痕形成的活性,作用机制与止血、调节炎症因子、胶原蛋白沉积、胶原纤维重塑以及瘢痕形成相关因子表达有密切关联。其中SNCP效果最好,SNH次之,到SNE。胶原蛋白肽在其中起到了重要作用,其含量越高,其效果越好。(3)通过紫外光谱扫描、SDS-PAGE电泳、红外光谱扫描和差示扫描量热法(DSC)对SNC进行理化特性分析,并通过高效液相色谱和氨基酸分析仪对SNCP进行分子量分布和游离氨基酸分析。结果表明SNC主要由α1和α2链构成,且存在三螺旋结构,变性温度32.8℃。SNCP的肽链分子量分布在5 000 Da、3 000Da和1 000 Da以下的,分别占81.95%、67.13%和34.36%,其游离氨基酸含量占SNCP的4.16%,精氨酸和脯氨酸共占其中27.5%,与伤口愈合相关的氨基酸含量较高。(4)SNCP通过Sephadex G25凝胶柱分离纯化,得出F1和F2两个组分,以细胞增殖实验评价SNCP及F1和F2的促愈合活性。结果表明SNCP和F2均具有促进HUVEC、Hacat和HSF增殖活性,相同浓度下,F2可以极大促进三种细胞增殖。