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第一部分 5-氟尿嘧啶和奥沙利铂术前放化疗治疗局部晚期直肠癌:Ⅱ期临床试验的长期结果目的:观察氟尿嘧啶,甲酰四氢叶酸和奥沙利铂联合进行术前同步化放疗治疗局部晚期直肠癌患者的长期结果。方法:从2002年2月至2006年1 1月,共入组了 58名局部晚期直肠癌（T3-4和/或N+M0）患者,行术前同步放化疗。主要研究终点包括肿瘤退缩情况、保肛率、毒副反应,次要终点包括局部复发和远处转移的累积发生率,无病生存率和总体生存率。结果:58名患者参加了该研究,所有患者均完成术前的同步放化疗,其中中位随访时间达138个月（109至151个月）。53名患者接受了 TME手术,其中1名行R1切除术,2名行R2切除术。患者手术后标本的评估依据肿瘤退缩分级标准,总有效率为32/55（58%）,其中肿瘤完全缓解率（complete response percent,pCR）为11/55名（20%）,体内仅检出循环肿瘤细胞的比率为21/55名（38%）。在毒性方面,未发生4级毒性和术后死亡,9名患者（16%）发生3级毒性。腹泻和直肠炎是最常见的毒副作用。2名患者发生2级直肠炎（14%）,4名患者发生3级直肠炎。10名患者（17%）发生2级腹泻,3名患者（5%）发生3级腹泻。严重的神经毒性未观察到,观察到轻度神经毒性,其中9名患者（16%）发生1级感觉神经病变。骨髓抑制轻微,一名患者分别发生3级中性粒细胞减少和血栓形成。2名患者（3%）发生3级疲劳。32名患者在随访结束时死亡;其中28人（87.5%）死于肿瘤疾病。51名R0/R1切除术患者中,仅1名局部复发,21名仅有远处转移,4名同时远处和局部复发。两名R2切除术患者均死于远处转移。在远处转移的27名患者中,发生多器官转移的为6名。发生最常见的转移部位（n=14）是肺,其次是肝脏（n=1 1）,骨骼（n=5）,腹膜后淋巴结（n=3）和卵巢（n=1）。5年和10年局部复发的累积发生率分别为12.1%和12.1%。中位局部复发时间为22个月（7～43个月）,5年和10年远处转移的累积发生率分别为51.3%和53.4%。中位远处转移时间为16个月（6至74个月）。接受术前放化疗加完全全直肠系膜切除术的患者的无病生存率在5年时为47.2%,在10年时为45.1%。接受术前同步放化疗加TME手术的患者总生存率在5年时为54.7%,在10年时为43.2%。意向治疗人群的总生存率在5年时为50.0%,在10年时为39.5%。意向治疗人群的无病生存率在5年时为43.7%,在10年时为41.8%。评估各种潜在预后因素的价值,包括肛门距离,性别,年龄,临床T分类,临床N分类和病理完全缓解,预测局部复发,远处转移,无病生存和总体生存。结果单变量分析显示,病理完全缓解与局部复发,远处转移,无病生存和总生存相关（P＜0.05）。结论:在术前放化疗和全直肠系膜切除术后,远处转移仍然是局部晚期直肠癌患者治疗的主要失败模式。病理完全缓解是术前放化疗后局部晚期直肠癌的独立预后因素。第二部分 局部晚期直肠癌术前同步放化疗敏感性预测标志物筛选目的:研究局部晚期直肠癌患者miRNA-519b-3p表达量与术前放化疗应答的相关性。方法:局部晚期直肠癌患者组织内提取总RNA,采用实时定量PCR法,评估miRNA-519b-3p表达变化,合成miRNA-519b-3p模拟物（mimics）及miRNA-519b-3p所对应的si-RNA转染HCT116或SW480细胞,细胞水平验证miRNA-519b-3p表达量与患者对放化疗应答的相关性。结果:根据微阵列数据（GSE98959）评估miRNA表达水平,上调水平最显著的miRNA为miRNA-519b-3p（P＜0.05）。q-PCR 结果表明高响应放化疗的患者（n=21）体内 miRNA-519b-3p的表达量明显比非应答者要高（n=34）（P＜0.05）,在LARC的应答者中高度表达。miRNA-519b-3p表达通过原位杂交（ISH）在应答者和非应答者直肠癌中进行评估,结果可见LARC应答者中miRNA-519b-3p的表达水平显著高于非应答者组。基于miRNA-519b-3p表达的ROC曲线分析结果显示,miRNA-519b-3p相关曲线下面积（area underthe cure,AUC）达0.87,特异性和敏感性分别为69%和100%。55名LARC患者miRNA-519b-3p的AUC、敏感性和特异性分别为0.91、100%和81%。分别单独瞬转miRNA-519b-3p模拟物或其siRNA至直肠癌HCT116或SW480细胞后,验证到miRNA-519b-3p确实表达上调或下调反应。CCK-8试验显示,miRNA-519b-3p mimics转染后HCT116和SW480细胞对同步放化疗反应更强烈（P＜0.05）,而miRNA-519b-3p siRNA转染后同步放化疗敏感度显著下降（P＜0.05）。CCK8测定显示miRNA-519b-3p过表达在CRT处理后抑制HCT116和SW480细胞增殖。在CRT处理后,通过FACS评估miRNA-519b-3p对HCT116和SW480细胞凋亡的影响。miRNA-519b-3p模拟物在放化疗后会增加HCT116和SW480细胞的凋亡,而miRNA-519b-3p抑制剂会减少细胞凋亡。结论:miRNA-519b-3p是局部晚期直肠癌术前同步放化疗敏感性预测的生物标志物第三部分 局部晚期直肠癌患者内miRNA-519b-3p通过靶向ARID4B提高术前放化疗的反应性目的:本研究的目的是探讨miRNA-519b-3p通过靶向人AT丰富结合域含蛋白4B（AT-rich interactive domain-containing protein 4B,ARID4B）提高局部晚期直肠癌患者术前放化疗的疗效。方法:采用双荧光素酶报告法验证miRNA-519b-3p与ARID4B结合位点;通过转染重组质粒来调节相关基因在细胞内的表达水平;利用异位移植瘤裸鼠模型,体内验证miRNA-519b-3p对ARID4B的调节作用;使用TargetScan和miRanda在线工具进行miRNA-519b-3p的靶基因生物信息学分析。结果:染色质重塑蛋白ARID4B,TargetScan总得分为-0.61,miRanda mirSVR评分为-0.9906,成为我们的目标分子,并在ARID4B的3’UTR中预测了结合位点。miRNA-519b-3p表达水平上调后,ARID4B 3’UTR-野生型质粒转染后HCT116和SW480细胞中的荧光素酶活性被显著抑制,反之亦然。miRNA-519b-3p和ARID4B之间存在显著的负相关关系（r=-0.55和P＜0.001）。qRT-PCR分析显示miRNA-519b-3p过表达显着降低HCT116和SW480细胞中ARID4B的水平。不应答放化疗的LARC患者体内ARID4B的表达水平较应答患者显著升高。分别瞬转miRNA-519b-3p 模拟物至直肠癌 HCT116 和 SW480 细胞中,western blot 和 q-PCR 证明 ARID4B含量增加,ARID4B从基因层面及蛋白层面均恢复至对照组水平。上调miRNA-519b-3p表达增强HCT116和SW480细胞对于放化疗的敏感性,而异位表达同时促进ARID4B的敏感度下降,ARID4B的过表达增加放化疗后HCT116和SW480细胞的增殖能力,ARID4B过表达降低放化疗后HCT116和SW480细胞的凋亡。裸鼠异种移植实验中,miRNA-519b-3p模拟物对于其肿瘤生长具有抑制作用,而ARID4B的高表达却能对此效应进行逆转。结论:在直肠癌中证实miRNA-519b-3p可靶向ARID4B,可参与针对pCRT的反应。miRNA-519b-3p可靶向ARID4B,以此提高局部晚期直肠癌患者的术前放化疗敏感度。