自首次从土壤中分离得到非致病性的生产L-谷氨酸(L-Glutamic acid,L-Glu)的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)以来,其出色的氨基酸生物合成能力及优良的生物安全性使其成为氨基酸工业生产中最重要的平台微生物之一。本研究主要是从土壤中分离筛选能够分泌L-苏氨酸(L-Threonine,L-Thr)的谷氨酸棒杆菌,并以其作为基盘细胞。采用诱变育种与代谢工程相结合的技术手段,构建高产L-苏氨酸的工程菌。主要研究内容如下:(1)根据苏氨酸生物合成以及谷氨酸棒杆菌的生长特性,以含有低浓度L-苏氨酸结构类似物平板,定向分离L-苏氨酸产生菌株。并运用纸层析法氨基酸对应Rf值定性和色斑深浅大小半定量进行高通量初筛,经过摇瓶复筛获得具有合成与积累L-苏氨酸能力的野生型菌株。其中编号为MD4027,形态学特征及基于16S rRNA基因的分子鉴定。结果显示其亲缘关系最接近为谷氨酸棒杆菌,且L-苏氨酸积累量达0.23 g/L,成功获得新的产L-苏氨酸的谷氨酸棒杆菌。(2)以MD4027为研究对象,通过优化ARTP的处理条件。首先采用青霉素法淘汰野生型,点植对照法筛选营养缺陷型,再经过96微孔板高通量初筛和摇瓶复筛,获得一株具有甲硫氨酸和异亮氨酸双缺陷(Met~-/Ile~-)且遗传稳定的L-苏氨酸高产菌株,编号为MT-4,摇瓶产酸达2.65 g/L,较出发菌MD4027提高了10.5倍。(3)运用无痕敲除载体pK18mobsacB,修饰基因glyR,削弱L-苏氨酸的胞內降解,进一步提高L-苏氨酸的积累量,成功构建L-苏氨酸修饰菌株。编号为C.glutmicum T11,其摇瓶L-苏氨酸产量达3.16 g/L,较C.glutmicum MT-4提高19.2%。(4)进一步优化C.glutmicum T11,以L-苏氨酸合成途径中的关键酶基因lysC,asdA,hom,thrB为研究对象,采用外源高效表达的方式进一步提高L-苏氨酸合成的碳流量。以强启动子Ptac为调控元件,对关键酶基因实施单个及多个基因的串联表达。通过分析关键酶基因lysC的功能并对其功能部位(Ala 279 Thr)进行定点突变有效解除L-苏氨酸反馈抑制。最终获得的T11/pZ-lys~rasd摇瓶发酵产L-苏氨酸达4.8 g/L,较C.glutmicum T11产酸提高51.9%。(5)在原有培养基的基础上,对C.glutmicum T11/pZ-lys~rasd工程菌进行发酵条件以及培养基优化试验,获得其最适L-苏氨酸发酵培养基配方。结果显示,优化后的配方摇瓶产酸值最高达到5.7 g/L,较原有配方提高了18.8%。在优化配方基础上,对C.glutmicum T11/pZ-lys~rasd进行30 L罐上补料分批发酵,通过现有的发酵工艺,实现修饰菌株C.glutmicum T11/pZ-lys~rasd发酵液L-苏氨酸浓度最高可达54.6 g/L,较未优化配方提高32.5%。