研究背景和目的随着社会老龄化的发展,牙齿缺失已经成为影响人类生活质量和健康的重要因素。而我国作为一个发展中的人口大国,由于人们卫生意识和医疗条件的限制,牙齿缺失的发生率在人群中相当高。由于目前的各种修复方法存在种种弊端,因此,如何使牙齿再生,一直是口腔医学研究者们追逐的梦想。近年来,随着组织工程、干细胞等技术的不断进步,我们离拥有“第三副牙齿”的梦想也越来越近了。在构建组织工程牙齿过程中,矿化能力己成为种子细胞能否成功形成牙体硬组织的关键因素。学者们不断探索牙齿生物矿化的调控机制。然而,到目前为止,我们对牙齿发育过程中的矿化调控机制尚未完全了解。生物矿化过程是一个精密调控的生理过程。Mann等人认为生物体内的矿化过程可分为三个阶段：(1)超分子预组装(Supramolecular Preorganization):在矿物沉积前构造出一个高度有序的反应环境,该环境决定了无机矿物成核的位置。(2)分子界面识别(Interfacial Molecular Recognition)：在己形成的超分子框架的控制下,无机矿物质于无机/有机界面处自溶液中成核。(3)细胞调控(Cellular Processing):已形成的矿物晶核在超分子框架的控制下继续生长,在细胞的参与下组装成高级结构,其中生物矿物晶体被赋予了独特的结构和形态,并产生了复杂的微结构和超微结构组织。人体中的硬组织,如牙齿、骨骼,都是生物矿化过程的产物。在生理条件下,通过细胞的参与、调节,各种生物活性因子有序作用,人体生成了具有特殊形态和功能的硬组织(矿化组织)。而在体外利用物理或化学的方法,合成类似的矿化物则需要相当苛刻的条件。因此,生理条件下的矿化,细胞和各种生物活性因子的调控是起到决定性作用的。但如何在体外条件下重现细胞及各种生物活性因子的调控作用,一直是生物矿化研究领域密切关注并亟待解决的问题。自2000年发现牙髓干细胞以来,学者对其展开了深入研究,以牙髓干细胞为模型寻找促进矿化的方法,探讨矿化机制。从牙髓中分离培养的成体干细胞在体外和支架材料复合后,移植到动物体内,已成功获得了类似牙髓-牙本质复合体的结构。到目前为止,学者们对牙髓干细胞的研究主要集中于正常牙髓干细胞,然而,在体牙髓干细胞形成修复性牙本质是当牙齿受到磨损、龋损等慢性刺激的情况下发挥作用的,那么深龋下牙髓干细胞的生物学特性有何改变,发生这种变化的原因何在呢?蛋白质组学是近年来发展起来的在生命科学乃至自然科学领域最活跃的学科。本课题从正常牙髓干细胞和深龋牙髓干细胞的生物学差异出发,利用高通量的双向凝胶电泳联合质谱鉴定的蛋白质学策略,筛选与矿化相关的蛋白,并对该蛋白的功能进行验证,研究结果为探索牙髓干细胞的矿化机制及寻找矿化标记物提供了理论依据。本论文主要包括以下四章内容：第一章：深龋牙髓干细胞的分离培养与鉴定本章实验主要比较组织块法、酶消化法、及改良组织块酶消化法分别分离培养8例共24例深龋牙髓干细胞,并利用正常牙髓干细胞做对照,结果表明组织块法、酶消化法及改良组织块酶消化法均可以培养出人龋坏牙髓干细胞。改良组织块酶消化法采用盖玻片轻压组织块的方法,保证组织块能牢固的贴附于孔板上,经酶消化的组织块变得松散,有利于培养液渗透到组织块内,显微镜下观察组织块透光性好,有利于细胞从组织块内游出,本实验证明利用改良组织块酶消化法将正常和深龋牙髓组织接种4、5天后即有细胞从组织块内游出,并且可以形成明显的细胞晕,可以培养出状态良好的深龋牙髓干细胞。改良组织块酶消化法保证了在较短的时间内获得大量的细胞,是一种理想的原代培养方法,为我们后续研究奠定了实验基础。第二章：正常与深龋牙髓干细胞生物学特性的比较为了比较正常和深龋牙髓干细胞生物学特性的差异,我们利用MTT、流式细胞仪及检测克隆形成能力的方法比较了两种细胞增殖能力的差异；矿化诱导液诱导正常和深龋牙髓干细胞后,比较两者形成矿化结节的能力,碱性磷酸酶试剂盒检测ALP活性,qRT-PCR检测成骨相关基因的表达。结果表明,深龋牙髓干细胞较正常牙髓干细胞表现出了较强的增殖能力。经矿化诱导后深龋牙髓干细胞形成矿化结节的能力强于正常牙髓干细胞,同时也表现出了较强的ALP活性；qRT-PCR结果表明深龋牙髓干细胞内成骨成牙标记物的表达量较正常牙髓干细胞显著增高。第三章：深龋牙髓干细胞的蛋白质组学分析为了更好的理解牙髓干细胞的矿化机制,寻找深龋牙髓干细胞与正常牙髓干细胞产生生物学特性差异的原因,本实验运用荧光双向差异凝胶电泳对正常和深龋牙髓干细胞进行电泳分析,软件分析正常和深龋牙髓干细胞蛋白表达谱发现20个蛋白质斑点在两组凝胶中有显著性表达差异,其中1有10个在深龋牙髓干细胞中表达上调,10个在深龋牙髓干细胞中表达下调。利用质谱技术鉴定的相关蛋白,采用免疫印迹对筛选的部分差异蛋白(TCP-1, Stathmin)进行验证。并探讨候选蛋白在参与矿化过程可能发挥的作用。第四章：Stathmin蛋白生物学作用的基本机制探讨Stathmin是本实验筛选的矿化相关蛋白之一,又称p17, p18, p19, Op18,19K, Op18/Stathmin Metablastin等,是近年来发现的在序列上高度保守的,在细胞的增殖和分化中十分重要的可溶性微管辅助蛋白。Stathmin由149个氨基酸组成,分子量19kD,pH515-612,有两个不同的亚型α/β。蛋白质组学筛选并鉴定Stathmin在正常牙髓干细胞中表达上调,目前关于其对牙髓干细胞生物学特性的影响尚未见报道。为了探讨Stathmin对牙髓干细胞生物学特性的影响,我们构建了Stathmin过表达和表达抑制的载体,并转染到正常牙髓干细胞内,qRT-PCR验证过表达及沉默效率。过表达Stathmin后牙髓干细胞形成矿化结节的能力显著增强,表达成骨相关基因(BSP、RUNX2、OCN)的量也较对照组显著增强；沉默Stathmin后牙髓干细胞形成矿化结节的能力显著减弱,同时可以下调成骨相关基因的表达。综合以上结果Stathmin对牙髓干细胞的矿化能力具有一定调控作用,并呈正相关,本实验为揭示牙髓干细胞矿化机制,促进牙髓干细胞矿化能力提供新的思路。材料方法牙髓干细胞的分离培养标本取自南方医院口腔颌面外科,收集临床18-22岁患者因阻生而拔除的健康、完整的智齿为正常组,有深龋,剩余牙本质厚度约2mm,无自发痛等牙髓炎症状的智齿为深龋组(经患者本人及家属知情同意),牙齿拔除后置于PBS缓冲液内送至实验室,沿釉牙骨质界用高速手机环绕牙颈部磨出一定深度的沟槽,注意不能穿髓。在超净台内将牙齿沿沟槽劈开,无菌条件下取出牙髓(去除根尖孔端约2mm的牙髓)置于PBS缓冲液内。反复漂洗至少3次,对于深龋牙髓组织至少漂洗5次。细胞增殖能力的检测流式鉴定细胞周期收集5×105/mL正常牙髓干细胞和深龋牙髓干细胞,根据实验步骤,流式细胞仪上机,行细胞周期检测、分析。MTT法检测细胞增殖情况取对数生长期的第3代细胞,将正常牙髓干细胞和深龋牙髓干细胞以5×103/孔的密度接种于96孔板,在酶联免疫检测仪上测定490nm波长下各孔光吸收值,求均值。克隆形成实验取对数生长期的细胞,调整每组细胞密度至10-15个/mL,吹打混匀,接种于96孔板内,常规倒置显微镜下观察克隆形成情况,21d后甲苯胺蓝染色并计算形成克隆数(以>50个细胞为一个克隆)。碱性磷酸酶(ALP)活性及矿化诱导为了比较细胞ALP水平变化情况,将正常牙髓干细胞和深龋牙髓干细胞分别按5×103个/孔接种于96孔板内,按照ALP试剂盒说明操作,检测各组细胞的ALP活性,空白孔调零,检测520nm下各孔吸光度(OD)值,检测细胞的ALP活性。正常牙髓干细胞和深龋牙髓干细胞的单细胞悬液以1×104细胞/孔接种于24孔板,茜素红染色法鉴定矿化结节。双向凝胶电泳分离蛋白质正常和深龋牙髓干细胞荧光双向凝胶电泳,等点聚焦电泳和SDS-PAGE凝胶电泳,质谱分析,文献回顾筛选相关蛋白,免疫印迹验证。qRT-PCR抽提细胞的总RNA,逆转录成cDNA后,采用sybgreen法进行PCR扩增,通过相对定量以2-△△ct值代表基因的相对表达强度。Western blot抽提细胞总蛋白,采用BCA法进行蛋白浓度测定,10%SDS-PAGE电泳、转膜、免疫杂交、显影及定影,蛋白相对表达强度采用Quantity One软件进行定量。病毒获取过表达Stathmin慢病毒表达载体：以正常人外周血为模板,扩增Stathmin目的基因,并将其连接到GV261载体,包装细胞用：293T细胞,获得充足质粒GV261-Stathmin。沉默Stathmin慢病毒表达载体为pGLV-H1-GFP+Puro,包装系统为PG Packaging Plasmid Mix,包装细胞：293T细胞,由上海吉玛制药技术有限公司包装。细胞转染慢病毒感染：将慢病毒悬液按照不同的病毒感染复数感染正常牙髓干细胞,48h后荧光显微镜下观察绿色荧光(green fluorescent protein, GFP)发光情况。鉴于慢病毒感染效率较高,以GFP为标记,利用流式细胞仪进行细胞分选获得GFP阳性细胞,分别建立过表达Stathmin、稳定干扰Stathmin的正常牙髓干细胞。统计学分析采用SPSS13.0统计软件进行数据分析,MTT、ALP采用重复测量的方差分析,检测沉默Stathmin的qRT-PCR采用单因素方差分析,正常和深龋牙髓干细胞克隆形成率、qRT-PCR检测正常和深龋牙髓干细胞矿化相关基因时采用独立样本t检验进行显著性分析,其他涉及到两组数据比较均采用独立样本t检验进行显著性分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.深龋牙髓干细胞的生物学特性本实验利用酶消化法、组织块法、组织块酶消化法均可分离培养出深龋牙髓干细胞,但改良组织块酶消化可以在短时间内获得大量细胞,是一种较好的原代培养方法。流式细胞仪检测间充质干细胞标记物的表达,与正常牙髓干细胞相比,深龋牙髓干细胞表达间充干细胞标记物(Stro-1、 CD90、CD105)的含量显著增高,表明深龋牙髓干细胞较正常牙髓干细胞有更强的干细胞特性(Stro-1:t=3.325, P=0.029; CD90:t=4.446, P=0.011; CD105:t=3.411, P=0.027)。将两种牙髓干细胞三向诱导,结果表明正常和深龋牙髓干细胞均具有成脂成骨及成软骨的能力,且深龋牙髓干细胞形成矿化结节的能力的强于正常牙髓干细胞。为了比较两种细胞的增殖能力,本实验分别采用MTT、细胞周期、及检测细胞克隆形成能力的方法,从三方面比较正常和深龋牙髓干细胞增殖能力的差异。MTT结果显示从第3天开始深龋牙髓干细胞较正常牙髓干细胞表现出较高的OD值,通过7天的比较,结果表明深龋牙髓干细胞较正常牙髓干细胞具有较强的增殖能力(F=7.350,P=0.000)；细胞周期显示深龋牙髓干细胞G2M+S期细胞比例高于正常牙髓干细胞；同时深龋牙髓干细胞较正常牙髓干细胞表现出了较强的克隆形成能力(t=9.798,P=0.001)。为了比较两种细胞的矿化能力,将正常和深龋牙髓干细胞分别矿化诱导,诱导后深龋牙髓干细胞形成矿化结节的能力强于正常牙髓干细胞,同时深龋牙髓干细胞也表现出了较强的ALP活性(t=191.741, P=0.000); qRT-PCR结果表明深龋牙髓干细胞内成骨成牙标记物OCN(t=3.989,.P=0.003)、RUNX2(t=3.588, P=0.005)、ALP (t=6.044, P=0.000)、Osteonetin (t=2.270, P=0.047)、DSPP (t=-3.094,P=0.011)、BSP (t=5.847, P=0.000)的表达量较正常牙髓干细胞显著增高。2.深龋牙髓干细胞蛋白质组学及候选蛋白的生物学特性荧光双向差异凝胶电泳分析正常和深龋牙髓干细胞差异表达蛋白,质谱分析,发现20个蛋白质斑点在两组凝胶中有显著性表达差异,其中有10个在深龋牙髓干细胞中表达上调,10个在深龋牙髓干细胞中表达下调。并采用免疫印迹对筛选的部分差异表达蛋白进行验证,经文献回顾发现Stathmin与矿化关系密切。因此,我们构建了Stathmin过表达和表达抑制载体,并转染到正常牙髓干细胞内,结果表明上调Stathmin的表达可以增强牙髓干细胞形成矿化结节的能力及显著上调成骨相关基因BSP (t=-3.179,P=0.034)、OCN (t=-4.104, P=0.015)、 RUNX2(t=-3.565, P=0.023)的表达；下调Stathmin在牙髓干细胞内的表达后牙髓干细胞形成矿化结节的能力下降,同时显著下调成骨相关基因BSP (t=7.736,P=0.002)、OCN (t=3.670, P=0.021)、RUNX2(t=3.309, P=0.030)的表达。结论1.深龋牙髓内可以成功分离培养出牙髓干细胞,且其增殖与骨向分化能力较正常牙髓干细胞增强；2.利用蛋白质组学技术筛选深龋和正常牙髓干细胞差异表达蛋白,从蛋白水平揭示深龋牙髓干细胞与正常牙髓干细胞形成生物学特性差异的原因；3.矿化相关蛋白Stathmin对牙髓干细胞的矿化能力具有一定的调控作用,且呈正相关。