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背景：脑出血后继发性损伤会进一步加重血肿周围组织损伤和神经功能的恶化。临床上仍没有比较安全和有效的方法干预脑出血后继发性损伤，更加清晰的阐明脑出血后继发性损伤的病理机制尤为重要。细胞受到刺激或损伤后会向细胞外释放ATP，细胞外异常积聚的ATP激活P2X7受体所致的氧化应激在中枢神经系统变性疾病的发生发展中起着重要作用。目前，P2X7受体在脑出血后氧化应激损伤中研究甚少，本研究旨在探讨P2X7受体是否介导脑出血后氧化应激及其可能的机制。
方法：通过立体定位注射VII型胶原酶构建C57BL/6小鼠脑出血模型，后续研究共分为三个部分。第一部分首先通过Westernblot检测脑出血后血肿周围组织不同时间点P2X7受体的表达变化，免疫荧光染色确定P2X7受体表达的细胞定位。进一步分别经侧脑室注射P2X7受体的激动剂BzATP和腹腔注射P2X7受体抑制剂A438079处理脑出血小鼠。通过Westernblot检测P2X7受体的表达；通过试剂盒检测血肿周围组织MDA、SOD、GSH和GSH/GSSH水平反映氧化应激程度；通过TUNEL染色检测血肿周围组织细胞凋亡；通过干湿重法测量脑含水量评估脑水肿程度；通过改良的Garcia评分、墙角实验和前肢放置实验评估小鼠的神经功能损伤。第二部分首先分别用P2X7受体的激动剂BzATP和抑制剂A438079处理脑出血小鼠，通过Westernblot检测小鼠血肿周围组织NOX2的表达。随后进一步经腹腔注射NOX2的抑制剂GSK2795039处理脑出血小鼠，通过试剂盒检测血肿周围组织MDA、SOD、GSH和GSH/GSSH水平反映氧化应激程度；通过干湿重法测量脑含水量评估脑水肿程度；通过改良的Garcia评分、墙角实验和前肢放置实验评估小鼠的神经功能损伤。第三部分首先分别用P2X7受体的激动剂BzATP和抑制剂A438079处理小鼠，通过Westernblot及免疫荧光染色检测血肿周围组织ERK1/2、JNK、p38、NF-κB及其相应的磷酸化蛋白p-ERK1/2、p-JNK、p-p38、p-NF-κB。进一步分别经侧脑室注射ERK1/2激活抑制剂U0126和NF-κB转录活性抑制剂JSH-23处理小鼠，通过Westernblot检测血肿周围组织NOX2的表达；通过试剂盒检测血肿周围组织MDA、SOD、GSH和GSH/GSSH比值水平反映氧化应激程度；通过TUNEL染色检测血肿周围组织细胞凋亡。
结果：在第一部分实验中，P2X7受体在小鼠脑出血后表达逐渐升高，在出血后24小时达到峰值，随后逐渐降低；免疫荧光染色表明血肿周围组织神经元表达P2X7受体比例最高。P2X7受体激动剂BzATP处理小鼠后进一步增加出血后24小时P2X7受体的表达，而P2X7受体抑制剂A438079处理能减少脑出血后P2X7受体的表达。通过抑制P2X7受体后能减少出血后24小时血肿周围组织MDA水平和提高SOD活力、GSH水平和GSH/GSSH比值；同时也能减轻脑出血后细胞凋亡、脑水肿和神经功能损伤。在第二部分研究中，P2X7受体激动剂BzATP处理小鼠后会进一步增加出血后24小时血肿周围组织NOX2的表达，而P2X7受体抑制剂A438079处理则能减少NOX2的表达。通过GSK2795039抑制NOX2后能减轻脑出血后P2X7受体活化所致的氧化应激、脑水肿和神经功能损伤。在第三部分研究中，P2X7受体激动剂BzATP处理小鼠后会进一步增加出血后24小时血肿周围组织ERK1/2和NF-κB的磷酸化水平，而P2X7受体抑制剂A438079处理则能减少血肿周围组织ERK1/2和NF-κB的磷酸化。通过U0126抑制脑出血后ERK1/2的激活，能减轻P2X7受体活化所介导的出血后24小时血肿周围组织NOX2表达上调、氧化应激和细胞凋亡。同时，通过JSH-23抑制NF-κB的转录活性后也能减轻P2X7受体活化所介导的出血后24小时血肿周围组织NOX2表达上调、氧化应激和细胞凋亡。
结论：我们的研究表明，脑出血后P2X7受体的活化通过激活ERK1/2和NF-κB信号通路加重NOX2介导的氧化应激。同时，新型的NOX2抑制剂GSK2795039用于治疗脑出血后继发性损伤可能具有远大前景。
方法：通过立体定位注射VII型胶原酶构建C57BL/6小鼠脑出血模型，后续研究共分为三个部分。第一部分首先通过Westernblot检测脑出血后血肿周围组织不同时间点P2X7受体的表达变化，免疫荧光染色确定P2X7受体表达的细胞定位。进一步分别经侧脑室注射P2X7受体的激动剂BzATP和腹腔注射P2X7受体抑制剂A438079处理脑出血小鼠。通过Westernblot检测P2X7受体的表达；通过试剂盒检测血肿周围组织MDA、SOD、GSH和GSH/GSSH水平反映氧化应激程度；通过TUNEL染色检测血肿周围组织细胞凋亡；通过干湿重法测量脑含水量评估脑水肿程度；通过改良的Garcia评分、墙角实验和前肢放置实验评估小鼠的神经功能损伤。第二部分首先分别用P2X7受体的激动剂BzATP和抑制剂A438079处理脑出血小鼠，通过Westernblot检测小鼠血肿周围组织NOX2的表达。随后进一步经腹腔注射NOX2的抑制剂GSK2795039处理脑出血小鼠，通过试剂盒检测血肿周围组织MDA、SOD、GSH和GSH/GSSH水平反映氧化应激程度；通过干湿重法测量脑含水量评估脑水肿程度；通过改良的Garcia评分、墙角实验和前肢放置实验评估小鼠的神经功能损伤。第三部分首先分别用P2X7受体的激动剂BzATP和抑制剂A438079处理小鼠，通过Westernblot及免疫荧光染色检测血肿周围组织ERK1/2、JNK、p38、NF-κB及其相应的磷酸化蛋白p-ERK1/2、p-JNK、p-p38、p-NF-κB。进一步分别经侧脑室注射ERK1/2激活抑制剂U0126和NF-κB转录活性抑制剂JSH-23处理小鼠，通过Westernblot检测血肿周围组织NOX2的表达；通过试剂盒检测血肿周围组织MDA、SOD、GSH和GSH/GSSH比值水平反映氧化应激程度；通过TUNEL染色检测血肿周围组织细胞凋亡。
结果：在第一部分实验中，P2X7受体在小鼠脑出血后表达逐渐升高，在出血后24小时达到峰值，随后逐渐降低；免疫荧光染色表明血肿周围组织神经元表达P2X7受体比例最高。P2X7受体激动剂BzATP处理小鼠后进一步增加出血后24小时P2X7受体的表达，而P2X7受体抑制剂A438079处理能减少脑出血后P2X7受体的表达。通过抑制P2X7受体后能减少出血后24小时血肿周围组织MDA水平和提高SOD活力、GSH水平和GSH/GSSH比值；同时也能减轻脑出血后细胞凋亡、脑水肿和神经功能损伤。在第二部分研究中，P2X7受体激动剂BzATP处理小鼠后会进一步增加出血后24小时血肿周围组织NOX2的表达，而P2X7受体抑制剂A438079处理则能减少NOX2的表达。通过GSK2795039抑制NOX2后能减轻脑出血后P2X7受体活化所致的氧化应激、脑水肿和神经功能损伤。在第三部分研究中，P2X7受体激动剂BzATP处理小鼠后会进一步增加出血后24小时血肿周围组织ERK1/2和NF-κB的磷酸化水平，而P2X7受体抑制剂A438079处理则能减少血肿周围组织ERK1/2和NF-κB的磷酸化。通过U0126抑制脑出血后ERK1/2的激活，能减轻P2X7受体活化所介导的出血后24小时血肿周围组织NOX2表达上调、氧化应激和细胞凋亡。同时，通过JSH-23抑制NF-κB的转录活性后也能减轻P2X7受体活化所介导的出血后24小时血肿周围组织NOX2表达上调、氧化应激和细胞凋亡。
结论：我们的研究表明，脑出血后P2X7受体的活化通过激活ERK1/2和NF-κB信号通路加重NOX2介导的氧化应激。同时，新型的NOX2抑制剂GSK2795039用于治疗脑出血后继发性损伤可能具有远大前景。