【背景】乳腺癌是全球范围内,女性患病率最高的恶性肿瘤,其发病率和死亡率依旧呈上升趋势。尽管手术、放化疗以及分子靶向治疗等综合治疗手段均达到改善了乳腺癌患者预后的效果,但其中化疗仍是乳腺癌治疗的基石。常用的乳腺癌化疗药物包括蒽环类、铂类等。长期用药会致使患者肿瘤细胞对药物的抗性增强,最终导致肿瘤复发甚至死亡。药物敏感性降低是对乳腺癌根治方法探索过程中最严峻的挑战。因此,阐明化疗药物的分子机制,调整化疗药物的使用策略依然是乳腺癌研究领域的重要方向。N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine,m6A）甲基化是真核生物最丰富的内源性RNA修饰方式之一,约占哺乳动物RNA修饰总甲基化的50%,并且在前体m RNA的剪切、micro RNA的加工、翻译调控以及m RNA降解过程中发挥着十分重要的作用。m6A甲基化修饰受到甲基转移酶（Writers）、去甲基化酶（Erasers）的可逆化修饰调控。其中“writers”主要由以下甲基转移酶复合物（methyltransferase complex,MTC）组成:甲基转移酶样因子3（METTL3）、甲基转移酶样因子（METTL14）和Wilms肿瘤1相关蛋白（WTAP）。此外近年来还发现了其他m6A Writers,包括METTL16、VIRMA、RBM15和ZCCHC4等;在RNA m6A去甲基化过程中发挥作用的去甲基化酶包括:脂肪和肥胖相关蛋白（FTO）和alk B同源物5（ALKBH5）,以及新发现的alk B同源物3（ALKBH3）;当RNA发生甲基化后,将会与结合蛋白（Readers）（主要包括YTH结构域家族YTHDF1-3和YTHDC1-2、核不均一核糖蛋白家族HNRNPC和HNRNPA2B1以及真核起始因子e IF3）结合,进而影响m RNA生命周期的各个阶段,包括RNA的剪切、出核、翻译过程,同时m6A修饰也参与调控m RNA的稳定和降解。越来越多的研究表明,RNA m6A修饰与乳腺癌的发生发展密切相关,但是在乳腺癌耐药过程中的功能和调控机制尚未明确。WTAP是细胞中m6A甲基转移酶复合物的关键组分之一,WTAP与选择性剪接有关,并专门针对核斑点（与m RNA输出相关的核结构）中的METTL3/14并与之相互作用,共定位于细胞核中参与m6A RNA甲基化。WTAP介导的剪接调节对于这种独特的核定位是必要的。尽管单体WTAP蛋白在细胞中尚未被发现具有甲基转移酶活性,但敲除WTAP后,细胞中m RNA的m6A修饰水平显著降低,甚至会产生比METTL3或METTL14敲降后对m6A修饰水平的影响更显著的效应。但是WTAP在乳腺癌发生发展以及治疗过程中发挥的功能目前尚不清楚。我们课题组前期发现,阿霉素等药物可以通过诱导DNA损伤效应,上调乳腺癌细胞的m6A甲基化修饰水平,但是其调控机制并不明确。阐明阿霉素诱发DNA损伤效应促进m6A修饰的作用和机制,将有助于揭示DNA损伤化疗药物对乳腺癌治疗耐药的产生,以及为提高DNA损伤化疗药物敏感性提供新的药物靶点。【目的】1.明确DNA损伤药物对乳腺癌细胞增殖和m6A甲基化修饰状态的影响;2.阐明DNA损伤药物对m6A甲基化修饰关键分子的表达及其亚细胞定位的影响;3.揭示RNA m6A甲基化修饰在调控乳腺癌细胞DNA损伤修复过程中的作用;4.分析DNA损伤效应促进WTAP转位入核的生物学效应和分子机制;【方法和结果】1.发现阿霉素、顺铂等DNA损伤化疗药物可引起乳腺癌细胞RNA m6A甲基化水平升高;采用MTT检测化疗药物对乳腺癌细胞增殖的抑制作用;采用Western-blot检测化疗药物对乳腺癌细胞DNA损伤;采用Trizol法提取乳腺癌细胞的RNA,纯化m RNA后,采用Dot blot法分析不同条件处理下乳腺癌细胞m RNA的m6A水平。结果显示DNA损伤化疗药物顺铂和阿霉素可使MDA-MB-231、HCC1937、T47-D和MCF-7等乳腺癌细胞系m RNA m6A修饰水平升高,并且这一效应具有剂量依赖性。并且X射线和致细胞DNA损伤药物博来霉素（ZEOCIN）均可以上调乳腺癌细胞RNA m6A水平。2.明确乳腺癌细胞RNA m6A甲基化水平升高是由于甲基化酶复合物关键分子WTAP入核增加所致,而不依赖于m6A甲基化修饰关键分子的表达变化;Western-blot和RT-q PCR分析显示,在不同的乳腺癌细胞系中,阿霉素或顺铂作用下m6A甲基化酶关键分子的RNA和蛋白水平均无显著差异;蛋白质核浆分离实验和免疫荧光实验证实了在各乳腺癌细胞系中,阿霉素可使甲基化酶复合物关键分子WTAP转位入核增加,且存在剂量依赖性。3.ATM磷酸化修饰WTAP并促进WTAP转位入核发挥DNA损伤修复功能为了进一步分析DNA损伤促进WTAP转位入核的原因,我们分析了WTAP的氨基酸序列特征。结果显示,在WTAP序列中存在着5个相对保守的ATM激酶磷酸化位点。我们利用免疫共沉淀技术发现,阿霉素诱发DNA损伤后,可以活化ATM（Ataxia-telangiectasia mutated,共济失调毛细血管扩张突变）,而ATM可以直接磷酸化修饰WTAP,高度提示WTAP是一个新的ATM磷酸化修饰底物,这可能是DNA损伤促进WTAP转位入核的主要原因。我们采用慢病毒感染技术成功构建WTAP过表达和敲降的MDA-MB-231细胞株,用阿霉素作用不同时间处理乳腺癌细胞后,Western blot发现,过表达WTAP可使乳腺癌细胞内的DNA损伤标志分子γH2AX升高的时间延后,而敲降WTAP可使γH2AX水平升高的时间提前;采用蛋白质免疫共沉淀技术发现ATM/ADR可以磷酸化WATP进而促进WTAP核转位。4.乳腺癌细胞RNA m6A甲基化水平升高主要参与DNA损伤应答通路;对MDA-MB-231亲本细胞和阿霉素处理组细胞进行MeRIP-Seq测序,结果显示细胞内RNA m6A修饰峰主要位于m RNA 3’UTR区近终止密码子区域5’-RRACU-3’基序中。乳腺癌细胞中,阿霉素可以促进m6A峰的形成。GO分析发现阿霉素可以促进乳腺癌细胞内与DNA损伤及修复相关的转录本发生m6A修饰,并且用RT-q PCR对相关分子进行了验证。同时,RT-q PCR显示WTAP与DNA损伤修复也存在关联,主要表现在同源重组修复通路以及范可尼贫血通路相关分子差异显著。【结论】1.阿霉素、顺铂等DNA损伤药物和X射线等可以上调乳腺癌细胞内RNA m6A甲基化修饰水平;2.首次发现RNA m6A甲基化修饰水平的上升与甲基化酶WTAP转位入核增加有关;3.首次发现DNA损伤促使ATM磷酸化WTAP进而介导WTAP的转位入核;4.WTAP可减轻乳腺癌细胞DNA损伤程度,而抑制WTAP入核可增强乳腺癌细胞对阿霉素的治疗敏感性;5.DNA损伤诱发WTAP转位入核,促进乳腺癌细胞DNA损伤修复下游基因的表达。