[研究背景]牙周病是口腔系统的常见病,与多种全身系统性疾病密切相关。其中,牙周病被认为是糖尿病的六大并发症之一。研究表明,糖尿病不仅会引起机体对牙周微生物的过度炎症反应、加重牙周病变,还可打破骨吸收-骨生成的平衡、加速牙周组织的持续破坏。牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells,PDLSCs）是一种多潜能干细胞,在牙周支持组织改建过程中发挥重要的调控作用,近年来已成为牙周缺损修复的种子细胞。然而许多证据表明,糖尿病患者持续存在的高血糖状态可通过多种机制损害PDLSC性能,抑制牙周组织修复进程。因此,如何挽救高糖环境中PDLSC性能成为糖尿病患者牙周病治疗的关键难题。二甲双胍是2型糖尿病的首选药。除降糖作用外,还具有抗炎、抗衰老等功能。研究发现二甲双胍能够减少细胞凋亡、促进细胞增殖和成骨向分化,提示其具有调控细胞生命活动的功能。但二甲双胍如何影响高糖环境中PDLSC成骨分化潜能仍不明确。另外,目前的体外细胞研究主要采用2D和3D两种不同的条件,但这两种条件下细胞的形态和生物学行为等存在明显差异,可能影响细胞应对外界刺激作出的反应。因此,我们首先探索了 2D和3D条件下高糖环境对PDLSC成骨分化潜能的影响,进而探索二甲双胍对高糖环境中PDLSC成骨分化潜能的调控作用及机制,以期为糖尿病患者牙周组织再生方案的制订提供新思路。本课题主要从以下三个方面进行研究:第一部分2D和3D培养条件下高糖环境对PDLSC成骨分化潜能的影响目的:分离、培养人PDLSCs,并进行鉴定;探索2D和3D培养条件下高糖环境对PDLSC成骨分化潜能的影响,为后续实验提供依据。方法:分离、培养人PDLSCs,CCK-8和克隆形成实验检测细胞增殖能力;茜素红染色、油红O染色和阿利辛蓝染色检测细胞成骨、成脂和成软骨分化潜能;流式细胞术检测细胞的表面标记物。利用明胶和谷氨酰胺转移酶构建3D培养条件,显微镜下观察细胞的形态、鬼笔环肽染色观察细胞的伸展情况;使用低糖和高糖培养基配制的成骨诱导液分别对2D和3D条件下的PDLSCs进行培养,利用ALP染色和活性检测、茜素红染色和矿化结节定量、qRT-PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction）检测 PDLSC 成骨分化潜能。结果:成功分离并培养人PDLSCs,这些PDLSCs具有体外增殖以及成骨、成脂和成软骨分化潜能,并且表达间充质干细胞的表面标记物。镜下可见,2D条件下PDLSCs呈纺锤形单层排列,3D条件下PDLSCs呈圆形分层排列;鬼笔环肽结果显示,2D条件下PDLSCs呈梭形且有突起样结构,3D条件下PDLSCs呈圆球形没有突起。2D或3D条件下高糖处理组PDLSCs的ALP活性降低、形成矿化结节的量显著减少、成骨相关基因表达水平都明显降低。结论:体外成功分离、培养人PDLSCs,可用于后续实验;2D和3D条件下PDLSC形态和伸展情况存在差异;2D和3D条件下,高糖环境损害PDLSC成骨分化潜能。第二部分二甲双胍对高糖环境中PDLSC成骨分化潜能的影响目的:筛选二甲双胍的最佳作用浓度;探索二甲双胍对高糖环境中PDLSC成骨分化潜能的影响。方法:在高糖培养基中加入不同浓度二甲双胍（0 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L、500 μmol/L和1000 μmol/L）,利用CCK-8实验对比不同浓度二甲双胍处理后PDLSC细胞活力。使用低糖（CON）、高糖（HG）和含100 μmol/L二甲双胍的高糖培养基（HG+MET）配制的成骨诱导液分别对PDLSCs进行成骨诱导,利用ALP染色和活性检测、茜素红染色和矿化结节定量、qRT-PCR和Western blot等实验方法比较各组PDLSC成骨分化情况。结果:不同浓度二甲双胍处理后PDLSC活力没有明显变化,100 μmol/L二甲双胍处理后PDLSC增殖速率最快。HG+MET组PDLSCs的ALP活性、形成矿化结节的量以及成骨相关基因和蛋白的表达水平都比HG组显著升高,但是仍低于CON组水平。结论:100 μmol/L二甲双胍对PDLSCs的保护作用最强;二甲双胍可以改善高糖环境中PDLSC成骨分化潜能。第三部分二甲双胍调控高糖环境中PDLSC成骨分化潜能的机制研究目的:探索二甲双胍调控高糖环境中PDLSC成骨分化潜能的机制。方法:使用低糖、高糖和含100 μmol/L二甲双胍的高糖培养基配制成骨诱导液分别对PDLSCs进行成骨诱导,利用RNA-seq检测三组PDLSCs中差异性表达的mRNA,并用qRT-PCR和Western blot验证RNA-seq的结果。向PDLSCs中转染慢病毒空载体（LV-NC）或含NPR3慢病毒载体（LV-NPR3）,使用qRT-PCR、Western blot和免疫荧光染色检测转染效率;使用低糖或高糖培养基配制的成骨诱导液处理转染LV-NC的PDLSCs,使用含100 μmol/L二甲双胍的高糖培养基配制的成骨诱导液处理转染LV-NPR3的PDLSCs,利用ALP染色和活性检测、茜素红染色和矿化结节定量、qRT-PCR和Western blot 比较各组PDLSC成骨分化。利用qRT-PCR和ELISA检测CNP（C-type natriuretic peptide）的表达,利用 Western blot 检测 MAPK 信号通路关键蛋白的表达量;使用p38 MAPK和Erk1/2抑制剂处理转染LV-NPR3的PDLSCs后,使用含100 μmol/L二甲双胍的高糖培养基配制的成骨诱导液进行成骨诱导,检测各组PDLSC成骨分化。结果:RNA-seq结果显示AREG、GPR68、IGFBP5、SFRP2和NPR3五个差异性表达的mRNA符合筛选标准,qRT-PCR和Western blot结果显示NPR3的基因和蛋白表达方式与RNA-seq结果一致。转染LV-NPR3后,PDLSCs的ALP活性、形成矿化结节的量、成骨相关基因和蛋白的表达都显著降低,同时CNP表达降低、MAPK信号通路相关蛋白p-p38 MAPK和p-Erk1/2的表达明显升高。使用p38 MAPK或Erk1/2抑制剂处理后,PDLSCs中成骨相关基因和蛋白的表达水平显著升高。结论:二甲双胍通过抑制NPR3表达和其下游的MAPK信号通路活化进而改善高糖环境中PDLSC成骨分化潜能。[全文总结]本研究明确了高糖环境损害PDLSC性能,并首次揭示了二甲双胍可通过抑制NPR3表达和其下游MAPK信号通路活化来改善高糖环境中PDLSC成骨分化潜能,为糖尿病患者牙周组织再生策略的制订提供可行的理论依据。