背景:白癜风是一种常见的以表皮和或粘膜黑素细胞破坏为特征的色素脱失性皮肤病。全球发病率0.5-2.3%,我国约有近3000万患者,其发病率逐年上升,给家庭和社会造成了沉重负担。由于白癜风发病机制不明,导致治疗非常棘手,目前尚无针对白癜风的有效治疗药物或手段。在众多发病学说中,氧化应激和自身免疫被认为是导致黑素细胞被破坏引起白癜风发病的关键环节。近年来,我们课题组和国内外同行的一系列研究发现,诱发黑素细胞损伤的氧化应激是始动环节,而异常的自身免疫则是导致黑素细胞破坏的关键效应环节。但目前尚缺乏同时针对氧化应激和自身免疫的有效治疗手段。因此,深入理解白癜风发病机制,并针对关键发病环节建立有效的干预措施,对于白癜风的防治均具有重要意义。人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,h UMSCs）可分化为多种组织和细胞,是细胞治疗和再生医学的首选来源。目前研究表明,MSCs主要通过旁分泌外泌体来发挥作用。传统二维（two-dimension,2D）培养存在细胞增殖、分化和旁分泌功能弱的缺点。近些年的研究发现,三维（three-dimension,3D）培养提供了一个更符合人体内部的生存环境,其通过增强细胞与细胞、细胞与细胞外基质的接触,有效增强了细胞增殖、分化和旁分泌的功能。同时,与2D培养的MSCs来源外泌体（2D cultured MSCs-derived exosomes,2D-Exo）相比,3D培养MSCs来源外泌体（3D cultured MSCs-derived exosomes,3D-Exo）具有产量大、作用强、内含物种类多等特点。此外,3D-Exo的抗氧化,抗凋亡和免疫抑制作用更强。由此,我们提出以下研究假说:与2D-Exo相比,3D-Exo可通过发挥更强有效的抗氧化、抗凋亡和免疫抑制作用有效缓解白癜风患者黑素细胞发生的氧化应激和免疫损伤。目的:1.明确不同培养方式h UMSCs来源外泌体对白癜风小鼠模型的治疗作用;2.对比分析不同培养方式的h UMSCs来源外泌体对人黑素细胞氧化应激和免疫损伤的保护作用;3.阐明3D-Exo保护人黑素细胞抵抗氧化应激和自身免疫损伤的分子机制。方法:1.首先提取原代h UMSCs,使用75cm~2培养瓶和超低黏附培养板分别构建h UMSCs的2D和3D培养体系,然后对2D和3D培养体系来源的细胞进行鉴定;2.分别收集2D和3D培养条件下的h UMSCs上清液,超高速离心法收集2D-Exo和3D-Exo,并通过TEM、高分辨纳米流式和Western blot等方法对外泌体进行鉴定;3.用野生型C57BL/6小鼠构建白癜风小鼠模型。分别于尾静脉注射PBS、2D-Exo或3D-Exo,定期观察小鼠尾部白斑形成情况;免疫荧光和流式细胞术观察皮损局部黑素细胞、Treg和CD8+T细胞数量。流式细胞术检测脾脏、血液中Treg和CD8+T细胞数目,以明确h UMSCs来源外泌体对白癜风小鼠表皮黑素细胞的保护作用;4.2D-Exo和3D-Exo与来源于健康人外周血中PBMC和CD4+T细胞共孵育,流式细胞术检测Treg细胞数量和比例,以明确不同外泌体在体外对Treg细胞分化的影响;5.2D-Exo和3D-Exo预处理白癜风患者黑素细胞系PIG3V48h,H2O2再刺激24h后,CCK8法检测PIG3V细胞活性,流式细胞术检测PIG3V细胞凋亡及胞内ROS水平,以明确不同培养方式来源的外泌体对H2O2刺激的PIG3V细胞的保护作用;6.2D-Exo和3D-Exo中miRNAs表达谱的鉴定与分析研究;7.外泌体中的miRNAs调控靶基因参与黑素细胞抵抗氧化应激损伤和抑制自身免疫损伤的功能学验证与分子机制研究。结果:1.光学显微镜下可见75cm~2培养瓶中h UMSCs呈纺锤形,表现为成纤维细胞样的细胞群。超低黏附培养板中的h UMSCs悬浮培养48小时后,细胞自发聚集,形成致密的多细胞球体。通过流式细胞术检测发现,CD29和CD90作为h UMSCs表面标记物高度阳性（＞99%）,然而造血干细胞（HSCs）表面标记物CD34和CD45阴性表达（＜1%）;2.使用超高速离心法获取外泌体,随后使用BCA法定量外泌体中蛋白浓度,结果显示,从相同细胞数量来源的上清液中分离出来的3D-Exo中蛋白质含量明显高于2D-Exo。TEM显示外泌体呈典型的球形双层膜结构,高分辨率纳米流式细胞仪检测结果显示,外泌体直径在30-150nm之间,颗粒大小的主峰为65nm。Western blot检测发现,外泌体阳性标记CD9、Alix和TSG101均显著表达;3.给予白癜风小鼠外泌体治疗后发现,3D-Exo组明显延缓白癜风小鼠尾部色素脱失斑的形成。同时,对比PBS组,3D-Exo组白癜风小鼠尾部表皮、真皮和血液中的Treg数目显著增加,CD8+T细胞浸润显著减少,治疗效果明显优于2D-Exo组;4.体外实验表明,与PBS和2D-Exo组相比,3D-Exo组显著增加了PBMC和CD4+T细胞中的Treg数量和比例,说明外泌体可在体外促进Treg细胞的分化;5.CCK8实验结果显示,3D-Exo组明显减轻了H2O2诱导的PIG3V细胞毒性,且效果优于2D-Exo组。同时,流式细胞术检测发现,与2D-Exo组和PBS组相比,3D-Exo组PIG3V细胞凋亡和ROS水平显著降低;6.miRNA测序结果表明,与2D-Exo组相比,3D-Exo组57个miRNAs表达上调,36个miRNAs表达下调（fold change≥2,P＜0.05）。去除其中低表达的miRNAs,筛选出了26个差异表达的miRNAs。根据miRNA分析数据,我们选择表达上调的miRNAs中差异倍数排名前三的（miR-132-3p、miR-574-5p、miR-125b-5p）,并采用q RT-PCR进一步验证其表达情况。结果表明,与2D-Exo相比,3D-Exo中miR-132-3p、miR-574-5p和miR-125b-5p表达显著上调;7.首先评估这3个表达上调的miRNAs对PIG3V细胞功能的影响。我们发现miR-125b-5p显著减少了H2O2诱导的细胞毒性。同时,miR-125b-5p可减少PIG3V细胞中H2O2诱导的ROS水平和细胞凋亡。接着,我们评估了这3个表达增加的miRNAs对Treg分化的影响。我们发现,miR-132-3p显著促进了PBMC和CD4+T细胞中的Treg细胞的数量和比例。生物信息学及靶基因预测分析发现,miR-125b-5p主要通过抑制Bak1表达发挥抗氧化、抗凋亡作用,miR-132-3p主要通过抑制Sirt1表达发挥免疫抑制作用。结论:本课题首次明确了人脐带间充质干细胞来源外泌体在白癜风治疗中的重要作用,我们发现3D-Exo明显减少白癜风小鼠尾部的色素脱失,且通过促进Treg细胞分化发挥免疫抑制作用,通过减轻H2O2诱导的黑素细胞氧化应激发挥抗氧化、抗凋亡作用。同时,我们进一步阐明了3D-Exo发挥抗氧化和免疫抑制作用的具体分子机制。本研究不仅明确了不同培养条件下人脐带间充质干细胞来源外泌体在白癜风治疗中的关键作用,也阐明了其中的分子机制,为白癜风的临床治疗提供了新思路和新方法。