背景随着肿瘤治疗策略的不断精进和内镜普及率的逐渐增高,结直肠癌的发病率较往年有所下降,但其依旧是世界范围内肿瘤相关死亡的第三大主要原因[1,2]。在我国,结直肠癌是临床常见的恶性肿瘤之一,其发病率位居前三[3]。肿瘤转移是结直肠癌患者高复发和高死亡率的首要原因之一,晚期肿瘤不仅降低患者治疗疗效,影响患者生存质量,也给国家造成极大的经济负担。肿瘤转移被广泛定义为一种以多种癌基因或抑癌基因异常突变为特征的基因病,常表现为致癌基因的不断累积,伴有抑癌基因的逐渐失活。在此过程中,细胞分子组成和表型不断发生变化,使癌细胞在原发部位不断生长增殖,并最终扩散、定植到远处器官[4]。因此,发现与肿瘤转移密切相关的基因,阐明其潜在机制并探究其临床应用价值无疑有着十分重要的意义。Sec62是内质网上的一种跨膜蛋白,以Sec复合物的形式存在于内质网膜上。生理状态下,Sec62在新生前体多肽进入内质网的过程中发挥关键调节作用,同时参与控制内质网内钙离子的流动从而维持内质网稳态[5]。现有研究证实Sec62的功能异常与多种肿瘤的发生和快速进展密切相关,Sec62在其中发挥重要调控作用。在消化系统肿瘤研究中,Sec62已逐渐为人所知。例如,在胃癌、肝癌、食管癌以及结直肠癌等常见消化道肿瘤中,Sec62均被证实参与调控肿瘤细胞的增殖、转移、耐药等恶性生物学过程。然而,在结直肠癌侵袭转移的过程中,Sec62的功能特点及潜在机制仍未得到深入挖掘和探索。目的本研究的研究目的在于探索Sec62在结直肠癌侵袭转移中的作用,并深入揭示其潜在作用机理,以期为临床上结直肠癌转移患者的治疗策略和疾病预后的制定和改善提供科学的实验基础和理论依据。1.明确Sec62在结直肠癌中的表达情况及其与临床病理特点、患者预后之间的关联。2.探索Sec62对结直肠癌主要恶性表型（增殖和转移）的影响。3.揭示Sec62促进结直肠癌侵袭转移的机制。4.探究分子化合物对于Sec62相关结直肠癌侵袭转移的潜在治疗效果。方法1.提取永生化正常结肠上皮细胞FHC以及多种结直肠癌细胞系的蛋白和m RNA,分别进行Western blot和q RT-PCR实验,检测Sec62在不同细胞系中的表达情况。经临床病理确诊后的配对结直肠癌和癌旁组织提取蛋白和m RNA,用于Western blot和q RT-PCR实验检测Sec62在结直肠癌与癌旁组织中的表达。2.通过公共数据库分析在结直肠原位癌及远处转移癌中Sec62的表达差异。利用免疫组织化学染色的方法检测Sec62在结直肠癌和配对癌旁组织芯片中的表达,并分析其表达与临床病理参数、患者预后等的相关性。3.采用慢病毒感染的方式在4种结直肠癌细胞系（HCT116、Caco-2和DLD-1、SW480）中分别构建Sec62功能获得和缺失的细胞模型,并验证病毒效率以备后续研究。利用CCK8、平板克隆、流式细胞术以及裸鼠皮下移植瘤模型等实验探究Sec62对结直肠癌细胞增殖能力的影响;利用Western blot实验检测Sec62表达与细胞周期进展相关分子CDK4,Cyclin D1和PCNA的相关性。同时运用Transwell迁移和侵袭实验、细胞划痕和裸鼠尾静脉注射肺转移实验,明确Sec62对结直肠癌细胞侵袭转移的作用。4.采用转录组学测序技术检测DLD-1细胞系敲减Sec62后下游分子m RNA表达的变化,分析筛选后选出下游功能靶分子UCA1。采用质粒转染和si RNA等技术构建UCA1过表达和下调细胞系后,运用q RT-PCR,Trans-well迁移和侵袭以及细胞划痕等实验明确UCA1在结直肠癌侵袭转移过程中的作用;同时运用挽救实验,即在Sec62稳定过表达和敲减的细胞系中分别下调和过表达UCA1的表达,以探究UCA1在Sec62介导的结直肠癌侵袭转移中的角色。5.利用Western blot实验技术探究Sec62对MPAK三条主要信号通路（p38,ERK,JNK）的调节作用;同时采用JNK抑制剂SP600125和激动剂Anisomycin处理Sec62过表达和敲减的细胞系,进一步验证JNK通路在Sec62促进结直肠癌侵袭转移中的作用。6.采用si RNA和q RT-PCR技术检测JNK通路下游关键转录因子ATF2与UCA1之间的表达关联性。JASPAR数据库预测转录因子ATF2对UCA1的转录调控位点。运用Firefly/Renilla双荧光素酶报告基因和染色质免疫共沉淀实验明确ATF2对UCA1上游启动子的转录调控作用。结果1.与永生化正常结肠上皮细胞和配对癌旁组织相比,Sec62在多种结直肠癌细胞系和结直肠癌组织中表达升高;另外,在临床收集的结直肠癌组织样本中,Sec62的表达水平与CRC肿瘤大小,淋巴结转移比例,AJCC分期等呈正相关,且Sec62表达水平越高,患者预后越差,提示Sec62具有预测结直肠癌患者预后的潜在临床价值;2.构建Sec62稳定过表达和敲减的细胞系后,利用CCK8、流式细胞术、裸鼠皮下移植瘤模型等证实过表达Sec62能加强结直肠癌细胞的体内外生长增殖能力;Western blot实验发现Sec62与细胞周期进展相关分子CDK4、Cyclin D1和PCNA等的表达水平具有明显关联性;同时Trans-well迁移和侵袭实验、细胞划痕和裸鼠尾静脉注射肺转移实验结果显示Sec62能显著提高结直肠癌细胞的体内外侵袭转移能力;3.采用RNA seq技术探索Sec62的潜在下游分子,分析筛选后选择UCA1作为Sec62的下游功能靶分子继续进行研究。GEO数据库分析结果显示UCA1在结直肠癌中表达升高,并且相较于原发灶,转移灶中表达尤其升高。q RT-PCR实验进一步表明UCA1不仅在结直肠癌细胞系中高表达,结直肠癌组织中其表达也显著高于邻近癌旁结肠组织。同时,对结直肠癌组织中Sec62和UCA1的表达进行相关性分析后发现二者具有正相关关系。利用功能挽救实验,即在稳定过表达和敲减Sec62的细胞系中分别下调和过表达UCA1后发现UCA1在Sec62促进结直肠癌侵袭转移的过程中发挥关键调控作用;4.Sec62稳定过表达和敲减的细胞系中利用Western blot实验检测MAPK经典通路蛋白的表达后发现P-JNK随Sec62表达的改变而发生明显变化,且在构建好的结直肠癌细胞中加入JNK激动剂Anisomycin和抑制剂SP600125后,结直肠癌细胞的侵袭迁移能力表现出相应的改变。5.利用si RNA技术在结直肠癌细胞中下调ATF2后,q RT-PCR实验结果显示UCA1的表达也随之降低,提示ATF2与UCA1的表达可能具有关联性;进一步进行Firefly/Renilla双荧光素酶报告基因后发现ATF2可正性调控UCA1的表达;染色质免疫共沉淀实验证实UCA1转录起始位点附近存在转录因子ATF2的结合位点,ATF2对UCA1的表达发挥转录调控作用。结论本研究首次明确了在结直肠癌侵袭转移的过程中存在Sec62/MAPK/ATF2/UCA1为核心轴的调节方式。具体而言,在结直肠癌中Sec62表达升高激活JNK信号通路,使JNK下游转录因子ATF2表达升高,ATF2能转录上调UCA1的表达,从而发挥促进结直肠癌侵袭转移的作用。此外,Sec62表达升高不仅被证实与CRC患者预后相关,而且其下游JNK通路的抑制剂被发现能减弱结直肠癌细胞的体外侵袭转移能力,具有潜在临床利用价值。本研究选取Sec62为研究对象,使内质网膜蛋白在结直肠癌侵袭转移中的作用首次得到阐明,多角度发掘了结直肠癌侵袭转移的发病机制并探索了潜在的干预治疗措施,进一步完善了内质网膜蛋白在调控肿瘤恶性生物学行为中的基础理论,丰富了内质网膜蛋白在肿瘤发生发展中的功能,也为下一步临床干预肿瘤转移提供了新的潜在治疗靶点。