【摘 要】
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异戊二烯是一种重要的有机化工原料,广泛应用于合成橡胶、香料、医药和精细化工品等。由于自然界释放的异戊二烯并不能直接被我们所利用,一直以来工业上生产异戊二烯的方法都是来源于石油资源,对环境造成了不可逆的污染,利用微生物细胞工厂合成异戊二烯已成为其绿色可持续生产的大势所趋。本文以真核模式生物酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为底盘,结合转录激活蛋白Gal4p的定向进化与表达调
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异戊二烯是一种重要的有机化工原料,广泛应用于合成橡胶、香料、医药和精细化工品等。由于自然界释放的异戊二烯并不能直接被我们所利用,一直以来工业上生产异戊二烯的方法都是来源于石油资源,对环境造成了不可逆的污染,利用微生物细胞工厂合成异戊二烯已成为其绿色可持续生产的大势所趋。本文以真核模式生物酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为底盘,结合转录激活蛋白Gal4p的定向进化与表达调控,对酿酒酵母合成异戊二烯的动态代谢调控进行了探讨。在本课题组前期研究中,为了充分利用细胞器中的乙酰辅酶A前体,通过将整条甲经戊酸（MVA）途径定位到线粒体中,显著提高了异戊二烯产量,但是对细胞生长却造成了不利的影响。为了缓解产物合成和细胞生长之间的矛盾,本研究致力于建立适用于异戊二烯合成的动态代谢调控策略。由于在敲除转录抑制因子GAL80的GAL调控系统中,转录激活蛋白Gal4p可通过控制GAL启动子实现对目标合成途径基因表达的开关,因此对Gal4p进行了定向进化,以获得在酵母生长温度（30℃）失活或者活性下降而在异戊二烯合成温度（37℃）活性恢复或者上升的温度敏感型Gal4p突变体。首先,利用乳清苷-5-磷酸脱羧酶（Ura3p）催化5-氟乳清酸（5-FOA）转化为5-氟尿嘧啶核苷酸造成细胞毒性的特点,建立生长指示的高通量筛选方法。初步筛选获得ep5、ep16、ep19、ep21这四株具有温度敏感表型的Gal4p突变体,随后将突变体引入线粒体改造的异戊二烯生产菌株M08H-CS中进行验证。其中突变体ep19对异戊二烯合成的促进效果最为明显,在30℃-37℃变温培养情况下产量提高了39.89%,生物量提高了 16.19%。但是,由于ep19不具备严谨的温度响应性,在酵母生长温度30℃下仍有明显的泄露表达,因此进而考察了利用热激基因SSA4的启动子对GAL4及其突变体进行表达调控从而提高温度调控严谨性的可能性。首先利用绿色荧光蛋白作为报告基因对含有不同个数热激元件（HSE）的启动子进行表征,获得具有最佳热激效应的热激启动子,然后将其与GAL4基因组成表达盒,转化至M08H-CS中,考察表达盒的拷贝数对异戊二烯产量的影响。结果发现,利用低拷贝质粒表达热激启动子控制下的Gal4ep19p突变体时,在30℃-37℃变温培养条件下异戊二烯产量提高了 132%。为了进一步验证该调控体系的有效性,对分别组成型表达野生型Gal4p、组成型表达Gal4ep19p 以及热激表达Gal4ep19p 的 M08H-CS-MLN-WT、M08H-CS-MLN-ep19 和 M08H-CS-MLN-SSA4-ep19菌株进行了好氧批次发酵。结果表明,M08H-CS-MLN-SSA4-ep19生长最佳,葡萄糖消耗速率也最高,最终异戊二烯产量达到对照菌株M08H-CS-MLN-WT的71.9%（220mg/Lvs.128mg/L）。最后,利用 M08H-CS-MLN-SSA4-ep19 和前期构建的细胞质改造菌株YXM54进行杂交构建双倍体菌株YH-SSA4-ep19,在补料发酵中,最高OD600达到249,最终异戊二烯产量达到2.2 g/L。本研究结合蛋白质工程和代谢工程手段,通过对转录激活蛋白进行分子改造和表达调控,构建了双重温度调控的异戊二烯生产菌株,缓解了线粒体改造菌株的代谢压力,并进一步提高了其异戊二烯产量。这项工作将为代谢改造酿酒酵母高效合成天然产物提供有益的方法借鉴。
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