对氧磷酶(Paraoxonase,PONs)是一类广谱的非专一性酶,包含PON1、PON2、PON3三个成员。PONs在体外可水解有机磷酸酯、芳香酯及内酯等一系列底物。哺乳动物体内的PON1主要由肝脏合成,并可分泌至血液,分布于血液、肝脏、肾脏、小肠等组织器官中。在人类血液中,绝大部分PON1通过N端疏水结构区与载脂蛋白A-I(ApoA-I)结合,结合后其酶活性和稳定性均极大提高。作为高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)上的主要结合蛋白之一,PON1可水解脂质过氧化物、破坏氧化型低密度脂蛋白(oxidized low densitylipoprotein,Ox-LDL)中的氧化磷脂、阻止低密度脂蛋白(low densitylipoprotein,LDL)和HDL的氧化修饰,因而可能是防治动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)和肝脏炎症等氧化相关疾病的一种新靶基因。　　 本论文首先研究了小鼠体内转基因表达hPON1对CCl4诱导的急性肝损伤的缓解作用。在小鼠胫骨头肌内注射真核表达质粒pcDNA3.0-PON1裸DNA并施加适当的电脉冲刺激,RT-PCR分析显示7天后注射部位肌细胞大量表达hPON1。骨骼肌表达的PON1可分泌进入血液,血清PON1活性在注射后第10天达到最高值,约为基础值的1.5倍。较高的血清PON1活性可维持3周以上。在PON1转基因表达10天后,小鼠腹腔注射CCl4诱导急性肝损伤,测定血清生化指标和进行肝脏病理切片分析。结果表明,hPON1转基因组小鼠血清转氨酶(ALT、AST)活性及丙二醛(MDA)水平比注射相同剂量CCl4的小鼠均有显著降低,肝脏病理学损伤也显著减轻,提示过表达的PON1可能通过阻止CCl4代谢产物引起的肝脏脂质过氧化而达到护肝的作用。肌注射电刺激介导的hPON1基因转移操作简便、成本低廉,可能在肝脏疾病预防和治疗中有一定的应用前景。　　 本论文第二部分研究了在载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)AS模型小鼠体内过表达hPON1对主动脉斑块形成的影响。此外,由于对氧磷酶家族中的另一成员PON3表现出与PON1相似的抗AS能力,我们还比较了过表达的hPON1和hPON3在抗AS形成效果和机制上的差异,并且鉴于PON1和PON3在抗AS中可能存在的互补作用,在AS模型小鼠体内同时过表达hPON1和hPON3以研究两者是否对AS疾病的形成具有协同作用。由于腺病毒载体转移率高,并已有上千例临床应用报道,实验选用了重组腺病毒AdPON1、AdPON3、AdPON1+AdPON3、AdLacZ或PBS尾静脉注射5周龄的ApoE-/-小鼠,重组腺病毒注射5天后,相应小鼠肝脏组织内可检测到hPON1或hPON3 mRNA的大量表达。AdPON1组小鼠血清内酯酶活性在注射后第8天比注射PBS或腺病毒AdLacZ的对照组小鼠升高3.7倍,较高的活性可维持3周左右。AdPON3组小鼠血清内酯酶活性未见明显变化。注射腺病毒3周后,AdPON1、AdPON3和AdPON1+AdPON3组小鼠动脉窦AS斑块面积较对照组小鼠均降低了约30％,AdPON1、AdPON3和AdPON1+AdPON3组之间无显著差异。AdPON1组小鼠血清抗氧化和抗炎症能力显著升高而AdPON3组无显著变化.AdPON1、AdPON3和AdPON1+AdPON3组小鼠腹腔巨噬细胞内胆固醇逆转运的能力与对照组小鼠相比均显著提升,且AdPON1+AdPON3组小鼠巨噬细胞内胆固醇外流比率显著高于AdPON1和AdPON3组。这些结果表明AS模型小鼠体内转基因过表达的hPON1可在早期斑块形成和发展过程中发挥抗AS作用,在使用相同滴度重组腺病毒介导的条件下,过表达的hPON1和hPON3对AS斑块形成的抑制效果无明显差异。hPON1抗AS形成的机制可能与其在血液中的抗氧化、抗炎能力相关,而过表达的hPON3则可能在细胞内发挥抗AS作用。hPON1和hPON3促进巨噬细胞内胆固醇外流具有明显的协同作用,其具体机制仍有待进一步研究。　　 鉴于PON1和ApoA-I在体内抗AS功能上可能有协同作用,我们尝试设计了hPON1和ApoA-I模拟肽4F的融合蛋白基因4F-PON1,并研究重组腺病毒介导的4F-PON1基因过表达对Apo-E基因敲除小鼠AS斑块形成的作用。结果并未检测出血清PON1的活性、体内抗氧化和抗炎能力、巨噬细胞内胆固醇外流效率以及AS斑块面积的显著变化。推测可能原因是融合蛋白结构的不确当造成了4F-PON1活性和功能的丢失。　　 总之,PON1由于自身具有抗氧化、抗炎功能而成为肝损伤和AS等疾病治疗潜在的靶基因。本文我们分别通过肌注射电刺激和重组腺病毒介导的方法实现了hPON1在疾病模型动物体内的过表达,证明了hPON1体内过表达可以缓解CCl4诱导的急性肝损伤,并可抑制ApoE-/-小鼠AS斑决的形成。尽管PON1在体内作用的天然生理底物和确切分子机制还有待进一步研究,但是,本论文已证明通过转基因表达提高体内PON1水平可以有效地对抗肝损伤和AS的发生和发展,为防治肝损伤和AS疾病提供了一种有前景的新策略。此外,本文还比较了过表达的hPON1和hPON3抗AS形成机制和效果上的差异,发现了hPON1和hPON3作用机制和作用位置上的差异以及在促进巨噬细胞胆固醇外流上的协同作用,为hPON1和hPON3的联合基因治疗奠定了理论基础。