鲫因其味道鲜美,已成为我国淡水养殖重要经济鱼类,但因近年来疱疹病毒性造血器官坏死病(herpesviral haematopoietic necrosis,HVHN)给中国鲫鱼养殖产业带来巨大经济损失,该病对鲫有高致死性,其病原主要是Ⅱ型鲤疱疹病毒(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2),所以建立快速、稳定检测鲫是否感染CyHV-2的方法防止CyHV-2的传播是必要的,本实验室研究得出,CyHV-2-ORF121基因在病鱼各个组织以及外周血中高表达,可作为开展CyHV-2病毒诊断技术研发的潜在靶向检测靶点,所以制备了CyHV-2-ORF121的多克隆抗体从免疫学层面进行检测。对正常鲫和感染CyHV-2的鲫进行转录组测序,分析测序结果显示,感染CyHV-2的鲫相对于正常鲫的干扰素调节因子(IRF)IRF1、IRF3、IRF8和IRF2bp2a基因显著性上调。IRF基因在抵御病毒入侵、病原体应答、细胞因子信号转导、细胞生长调节和造血细胞分化中都有重要作用,但其最重要的功能是参与干扰素(Interferon IFN)的转录调节。IRF在鱼类中有11个家族成员(IRF1-11),根据结构和功能分为4个亚家族,IRF-1亚家族、IRF-3亚家族、IRF-4亚家族和IRF-5亚家族。在IRF家族成员的N端有高度保守DNA结合结构域(DBD),包含IRF家族成员特有的色氨酸重复。本实验室通过构建pEGFP-IFN的真核表达质粒注射鲫发现CyHV-2病毒粒子的复制效率下降,延迟并降低了鲫的死亡率。因为IRF家族在IFN信号通路中的重要作用,所以对IRF家族成员的研究也在增加。本实验研究IRF1、IRF3、IRF8和IRF2bp2a这四个蛋白在组织中的表达特征和在poly(I:C)、LPS和CyHV-2的刺激下转录水平,对其免疫功能进行了初步研究。本研究制备了CyHV-2-ORF121多克隆抗体建立了免疫性更强的免疫学诊断技术和分析了病毒感染条件下以及poly(I:C)和LPS刺激下IRF1、IRF3、IRF8和IRF2bp2a的转录水平。研究主要包括以下三个内容:(1)本研究的目的是针对CyHV-2病毒ORF121基因(Gene Bank:AFJ20543.1)行原核表达系统的构建,纯化重组蛋白作为抗原免疫小鼠获得多克隆抗体,应用该抗体开展CyHV-2病毒诊断及其感染机制研究。以CyHV-2病毒感染细胞上清液为扩增模板,扩增ORF121基因构建至pGEX-4T原核表达载体。经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达rORF121重组蛋白利用尿素纯化,免疫6周龄小鼠制备多克隆抗体。实验结果显示CyHV-2病毒ORF121基因可在原核表达系统中高效表达目的重组蛋白rORF121,经SDS-PAGE分析大小约为56 Ku,主要以不可溶的包涵体存在。利用尿素溶解rORF121蛋白免疫小鼠获得抗ORF121蛋白的多克隆抗体,可特异性识别CyHV-2病毒感染RyuF-2细胞样品。进一步研究表明,利用CyHV-2感染RyuF-2细胞后,本研究制备的抗ORF121蛋白的多克隆抗体能够通过间接免疫荧光实验特异性识别CyHV-2病毒的感染情况。本研究制备的抗ORF121蛋白的多克隆抗体能够CyHV-2病毒诊断技术的构建以及深入开展CyHV-2病毒感染机制提供了良好的技术基础。(2)本研究对转录组获得的鲫IRF1、IRF3、IRF8和IRF2bp2a基因的开放阅读框(ORF)序列进行序列分析,鲫IRF1(CaIRF1)基因的ORF长867 bp,编码个288个氨基酸,预测蛋白分子质量为33.21 Ku,CaIRF3基因N端DBD结构域包含个6色氨酸重复。鲫IRF3基因的ORF长1 278 bp,编码425个氨基酸,预测蛋白分子质量为48.51 Ku,鲫IRF3基因N端DBD结构域包含4个色氨酸重复,通过氨基酸比对显示,鲫IRF3(CaIRF3)与犀角金线鲃IRF3(SaIRF3),南亚野鲮IRF3(LrIRF3),黄鳝IRF3(MaIRF3),虹鳟鱼IRF3(OmIRF3)的同源性分别为85.88%、69.41%、53.30%、50.88%。鲫IRF8(CaIRF8)基因的ORF长1 299 bp,编码432个氨基酸,预测蛋白分子质量为48.96 Ku,鲫IRF8基因N端DBD结构域包含5色氨酸重复,通过氨基酸比对显示,鲫IRF8(CaIRF8)与锦鲤IRF8(CcIRF8)、犀角金线鲃IRF8(SaIRF8)、白鱼IRF8(AgIRF8)、银大麻哈鱼IRF8(OkIRF8)的同源性分别为:89.35%、89.35%、78.22%、58%。鲫IRFIRF2bp2a(CaIRFIRF2bp2a)基因的ORF长1 476 bp,编码491个氨基酸,预测蛋白分子质量53.31 Ku,鲫IRF2bp2a基因N端DBD结构域包含2个色氨酸重复,通过氨基酸比对显示,鲫IRF2bp2a(CaIRFIRF2bp2a)与犀角金线鲃IRF2bp2a(SaIRFIRF2bp2a)、锦鲤IRF2bp2a(CcIRFIRF2bp2a)、斑马鱼IRF2bp2a(DrIRFIRF2bp2a)、高体鰤鱼IRF2bp2a(SdIRFIRF2bp2a)的同源性分别为:93.91%,93.89%,89.54%,80.90%。通过RT-PCR分析显示,poly(I:C)刺激后能上调IRF1、IRF3、IRF8和IRF2bp2a的转录水平,IRF1的转录水平在72h时达到最高值,是对照组的18倍。IRF3的转录水平在36h时达到最高,是对照组的6倍,IRF8在36h达到最高,是对照组的19倍,IRF2bp2a的转录水平在72h时达到最高,是对照组的9倍。LPS刺激后IRF1、IRF3、IRF8和IRF2bp2a的转录水平都有一定程度的上调。IRF3在2h表达量达到最高,随后迅速下降,逐渐上升恢复到正常表达水平,IRF1、IRF8和IRF2bp2a表达量在72h达到最高。(3)本研究的目的是为研究病毒感染过程中IRF1、IRF3、IRF8和IRF2bp2a的表达分析。病毒感染细胞后在不同时间点进行取样,用RT-PCR分析显示,RT-PCR分析显示IRF1、IRF3、IRF8和IRF2bp2a基因在所检测的组织皮肤、肾、脑、鳃、肌肉和脾中都组成性表达,但每个基因在不同组织中表达有差异。IRF1在脑中表达量最高,其次是鳃。IRF3、IRF8与IRF2bp2a在肌肉中表达量最高。RT-PCR分析显示,金鱼鳍条细胞在CyHV-2的感染过程中,IRF1、IRF3、IRF8和IRF2bp2a转录水平上调。本文研究表明,IRF1、IRF3、IRF8和IRF2bp2a可能具有潜在的抗病毒作用。