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多囊卵巢综合征(PCOS)是一种育龄期女性常见的内分泌代谢紊乱性疾病，主要特征为稀发排卵或无排卵、临床或/和生化高雄(HA)及卵巢多囊样性改变。PCOS患者临床表现呈现高度的异质性，常伴有胰岛素抵抗、高胰岛素血症、糖脂代谢异常、氧化应激(OS)及亚临床慢性炎症等。目前关于PCOS的发病机制尚未被完全阐明。
性激素结合球蛋白(SHBG)是一种由肝脏产生的同型二聚体血浆β球蛋白，能够结合和转运性激素，调节血液中游离性激素水平。SHBG与雄激素的亲和力最强，而与雌激素的亲和力稍弱，大多数由SHBG结合的雄激素不会发挥其生物学效应，只有少数未被SHBG结合的游离雄激素才能够发挥生物学效应。因此，SHBG在人体尤其是PCOS患者的雄激素水平调节中起着重要作用。
OS是指机体中抗氧化防御功能与氧化活性分子生成之间的失衡，当机体发生OS时，随着氧化活性分子的增加或/和高密度脂蛋白(HDL)抗氧化功能的减弱，HDL与低密度脂蛋白(LDL)易受到氧化活性分子的攻击而形成氧化修饰HDL(ox-HDL)与氧化修饰LDL(ox-LDL)，导致PCOS患者体内存在着较高浓度的氧化修饰脂蛋白。氧化修饰脂蛋白能够激活包括核转录因子-κB(NF-κB)在内的多条细胞信号通路，上调多种炎症因子的表达，促进单核细胞和炎症细胞聚集，而各种炎症细胞又会产生大量的氧化活性分子，进一步加重机体OS。PCOS患者常伴有OS和低水平SHBG，但是目前关于OS是否会影响SHBG的表达与分泌尚未见相关报道。我们通过超速离心分离纯化得到HDL和LDL，以Cu2+作为氧化剂，制备得到ox-HDL和ox-LDL。使用脂蛋白和氧化修饰脂蛋白处理培养HepG2细胞后，采用化学发光法测定细胞培养上清SHBG浓度，采用荧光定量PCR和WesternBlotting方法对SHBG及相关调节因子(HNF-4α、COUP-TF1、PPAR-γ)的基因和蛋白表达水平进行分析。结果表明，与对照组相比，随着脂蛋白和氧化修饰脂蛋白处理时间的增长，SHBG及HNF-4α基因表达水平显著降低(P＜0.05)，并且氧化修饰脂蛋白处理组比脂蛋白处理组降低更加显著(P＜0.05)；未发现处理组与对照组间COUP-TF1和PPAR-γ基因表达水平存在统计学差异(P＞0.05)。此外，脂蛋白及氧化修饰脂蛋白处理细胞72h后，与对照组相比，细胞培养上清SHBG浓度以及HNF-4α蛋白表达水平均显著降低(P＜0.05)，并且氧化修饰脂蛋白处理组比脂蛋白处理组降低更加显著(P＜0.05)；未发现处理组与对照组间COUP-TF1和PPAR-γ蛋白表达水平存在统计学差异(P＞0.05)，蛋白水平分析趋势与mRNA结果一致，表明脂蛋白及氧化修饰脂蛋白可能通过下调HNF-4α表达而进一步降低SHBG的表达及分泌，并且氧化修饰脂蛋白的下调作用强于脂蛋白。
此外，一些抗氧化酶基因多态性会导致抗氧化酶活性降低，使得机体氧化活性分子增加，继而发生OS。OS在PCOS的发生中扮演着重要角色，所以了解抗氧化酶基因多态性与PCOS发生的相关性对于PCOS发病机制的阐明具有重要意义。谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)和过氧化氢酶(CAT)是重要的细胞内抗氧化酶，与超氧化物歧化酶2(SOD2)共同维持机体OS的动态平衡。GPX1P198L和CATC-262T多态性均能够影响相应酶的活性，因此我们猜测GPX1P198L和CATC-262T多态性可能与PCOS的发生具有相关性。我们提取了PCOS患者及对照组血液样本DNA，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法确定研究对象CATC-262T和GPX1P198L位点基因型，通过统计分析确定两个位点与PCOS发生的相关性。结果表明GPX1P198L多态性与PCOS的发生具有相关性(P＜0.05)，并且在PCOS组中L等位基因携带者(PL+LL)相比于PP基因型有着更低的痤疮评分(P=0.001)，同时腰围、平均卵巢体积和丙二醛水平均有增加的趋势(P＜0.07)。我们还结合本课题组前期工作，对GPX1P198L、CATC-262T和SOD2A16V三种多态性进行两两联合分析后发现，与PP/VV组合基因型相比，PCOS组中PL+LL/AV+AA组合基因型频率明显高于对照组(4.7% vs 1.1%)，以年龄和BMI为协变量的多项Logistic回归模型表明PL+LL/AV+AA组合基因型具有最高的PCOS发生风险(OR=5.774，95%CI：2.243-14.863，P＜0.001)。
总之，我们发现脂蛋白及氧化修饰脂蛋白可能通过下调HNF-4α表达降低SHBG表达及分泌，并且氧化修饰脂蛋白下调作用明显强于脂蛋白，说明当PCOS患者体内发生OS时，随着氧化修饰脂蛋白的积累，可能会导致SHBG水平降低，从而使得体内游离雄激素升高，促进PCOS患者高雄激素血症的发生。此外，通过对抗氧化酶基因多态性研究发现GPX1P198L多态性与PCOS的发生具有相关性，同时PCOS组中L等位基因携带者(PL+LL)相比于PP基因型腰围、平均卵巢体积和丙二醛水平均有增加的趋势，推测GPX1P198L多态性可能会导致卵巢功能异常和增加OS水平从而增加PCOS发生风险。我们的研究表明OS在PCOS的发生中起着重要作用，因此，本论文的研究对PCOS发病机制的阐明能够提供一定的理论依据。
性激素结合球蛋白(SHBG)是一种由肝脏产生的同型二聚体血浆β球蛋白，能够结合和转运性激素，调节血液中游离性激素水平。SHBG与雄激素的亲和力最强，而与雌激素的亲和力稍弱，大多数由SHBG结合的雄激素不会发挥其生物学效应，只有少数未被SHBG结合的游离雄激素才能够发挥生物学效应。因此，SHBG在人体尤其是PCOS患者的雄激素水平调节中起着重要作用。
OS是指机体中抗氧化防御功能与氧化活性分子生成之间的失衡，当机体发生OS时，随着氧化活性分子的增加或/和高密度脂蛋白(HDL)抗氧化功能的减弱，HDL与低密度脂蛋白(LDL)易受到氧化活性分子的攻击而形成氧化修饰HDL(ox-HDL)与氧化修饰LDL(ox-LDL)，导致PCOS患者体内存在着较高浓度的氧化修饰脂蛋白。氧化修饰脂蛋白能够激活包括核转录因子-κB(NF-κB)在内的多条细胞信号通路，上调多种炎症因子的表达，促进单核细胞和炎症细胞聚集，而各种炎症细胞又会产生大量的氧化活性分子，进一步加重机体OS。PCOS患者常伴有OS和低水平SHBG，但是目前关于OS是否会影响SHBG的表达与分泌尚未见相关报道。我们通过超速离心分离纯化得到HDL和LDL，以Cu2+作为氧化剂，制备得到ox-HDL和ox-LDL。使用脂蛋白和氧化修饰脂蛋白处理培养HepG2细胞后，采用化学发光法测定细胞培养上清SHBG浓度，采用荧光定量PCR和WesternBlotting方法对SHBG及相关调节因子(HNF-4α、COUP-TF1、PPAR-γ)的基因和蛋白表达水平进行分析。结果表明，与对照组相比，随着脂蛋白和氧化修饰脂蛋白处理时间的增长，SHBG及HNF-4α基因表达水平显著降低(P＜0.05)，并且氧化修饰脂蛋白处理组比脂蛋白处理组降低更加显著(P＜0.05)；未发现处理组与对照组间COUP-TF1和PPAR-γ基因表达水平存在统计学差异(P＞0.05)。此外，脂蛋白及氧化修饰脂蛋白处理细胞72h后，与对照组相比，细胞培养上清SHBG浓度以及HNF-4α蛋白表达水平均显著降低(P＜0.05)，并且氧化修饰脂蛋白处理组比脂蛋白处理组降低更加显著(P＜0.05)；未发现处理组与对照组间COUP-TF1和PPAR-γ蛋白表达水平存在统计学差异(P＞0.05)，蛋白水平分析趋势与mRNA结果一致，表明脂蛋白及氧化修饰脂蛋白可能通过下调HNF-4α表达而进一步降低SHBG的表达及分泌，并且氧化修饰脂蛋白的下调作用强于脂蛋白。
此外，一些抗氧化酶基因多态性会导致抗氧化酶活性降低，使得机体氧化活性分子增加，继而发生OS。OS在PCOS的发生中扮演着重要角色，所以了解抗氧化酶基因多态性与PCOS发生的相关性对于PCOS发病机制的阐明具有重要意义。谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)和过氧化氢酶(CAT)是重要的细胞内抗氧化酶，与超氧化物歧化酶2(SOD2)共同维持机体OS的动态平衡。GPX1P198L和CATC-262T多态性均能够影响相应酶的活性，因此我们猜测GPX1P198L和CATC-262T多态性可能与PCOS的发生具有相关性。我们提取了PCOS患者及对照组血液样本DNA，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法确定研究对象CATC-262T和GPX1P198L位点基因型，通过统计分析确定两个位点与PCOS发生的相关性。结果表明GPX1P198L多态性与PCOS的发生具有相关性(P＜0.05)，并且在PCOS组中L等位基因携带者(PL+LL)相比于PP基因型有着更低的痤疮评分(P=0.001)，同时腰围、平均卵巢体积和丙二醛水平均有增加的趋势(P＜0.07)。我们还结合本课题组前期工作，对GPX1P198L、CATC-262T和SOD2A16V三种多态性进行两两联合分析后发现，与PP/VV组合基因型相比，PCOS组中PL+LL/AV+AA组合基因型频率明显高于对照组(4.7% vs 1.1%)，以年龄和BMI为协变量的多项Logistic回归模型表明PL+LL/AV+AA组合基因型具有最高的PCOS发生风险(OR=5.774，95%CI：2.243-14.863，P＜0.001)。
总之，我们发现脂蛋白及氧化修饰脂蛋白可能通过下调HNF-4α表达降低SHBG表达及分泌，并且氧化修饰脂蛋白下调作用明显强于脂蛋白，说明当PCOS患者体内发生OS时，随着氧化修饰脂蛋白的积累，可能会导致SHBG水平降低，从而使得体内游离雄激素升高，促进PCOS患者高雄激素血症的发生。此外，通过对抗氧化酶基因多态性研究发现GPX1P198L多态性与PCOS的发生具有相关性，同时PCOS组中L等位基因携带者(PL+LL)相比于PP基因型腰围、平均卵巢体积和丙二醛水平均有增加的趋势，推测GPX1P198L多态性可能会导致卵巢功能异常和增加OS水平从而增加PCOS发生风险。我们的研究表明OS在PCOS的发生中起着重要作用，因此，本论文的研究对PCOS发病机制的阐明能够提供一定的理论依据。