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目的:膜联蛋白a2(Anxa2)是一种Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,在多种肿瘤组织中高表达,参与调节肿瘤血管生成、细胞粘附、增殖、侵袭和转移等。课题组前期研究表明,Anxa2的高表达可以提高乳腺癌细胞的增殖和迁移能力。但是Anxa2影响乳腺癌的增殖和侵袭能力的具体分子机制尚不明确,因此,我们运用免疫共沉淀技术结合基于非标记定量技术(Label-free quantitation)的LC-MS/MS筛选并解析与Anxa2相互作用的蛋白质组,明确其相互作用模式,进一步探究Anxa2影响乳腺癌增殖和侵袭的分子机制。方法:1.应用基因克隆技术,构建携带Flag标签的真核表达载体Anxa2-FLAG,并用Western blotting技术检测蛋白的表达。2.应用免疫共沉淀技术结合LC-MS/MS分析筛选与Anxa2相互作用的蛋白组,并进一步应用 Gene Ontology(GO),Cluster of Orthologous Groups of proteins(COG),KEGG and VisAnt数据库进行分析和筛选,解析相互作用网络图。3.应用免疫共沉淀技术和免疫荧光技术明确Anxa2与Ebp1之间的相互作用。4.应用RNA干扰技术降低乳腺癌细胞系MDA-MB-231和T47D中Anxa2,Ebp1的蛋白表达水平,并用Western blotting技术检测蛋白表达量。5.应用MTT实验和克隆形成实验分别检测Ebp1降表达对MDA-MB-231和T47D细胞增殖能力和克隆形成能力的影响。6.应用划痕试验和体外侵袭实验分别检测Ebp1降表达对T47D细胞迁移能力和侵袭能力的影响。7.应用Real-time PCR技术和western blotting技术分别检测Ebp1降表达对Anxa2的mRNA和蛋白水平的影响,同时检测降表达Anxa2对Ebp1蛋白水平的影响。8.分析Ebp1降表达对cyclin D1,Erk1/2蛋白表达水平的影响,进一步明确Anxa2与Ebp1的相互作用调控乳腺癌增殖和侵袭的分子机制。结果:1、基因克隆技术获得携带Flag标签的真核表达载体Anxa2-FLAG,瞬时转染293T和T47D细胞,检测到Anxa2-FLAG特异性表达。2、免疫共沉淀结合LC-MS/MS分析鉴定与Anxa2相互作用蛋白质组,并且进行了 GO,COG和pathway功能分析和初步筛选,解析了相互作用网络图。3、免疫共沉淀结果显示Anxa2与Ebp1间存在相互作用,免疫荧光染色显示二者在细胞质内有明显的共定位。4、应用RNA干扰技术,转染MDA-MB-231,T47D细胞后筛选到Anxa2蛋白表达水平下降80-100%的2珠单克隆细胞,慢病毒感染MDA-MB-231,T47D细胞后筛选得到Ebp1蛋白水平下降70-90%的3珠不同干扰序列细胞。5、Ebp1表达水平下降后MDA-MB-231,T47D细胞增殖能力和克隆形成能力显著增强(P<0.05)。6、Ebp1表达水平下降后T47D细胞迁移能力和侵袭能力显著增强(P<0.05)。7、Ebp1表达水平下降对Anxa2的mRNA表达水平没有影响(P>0.05),但Anxa2,p-Anxa2蛋白水平明显提高;而Anxa2表达水平下降后Ebp1表达水平没有变化。8、Ebp1表达水平下降后可能通过调节cyclinD1的表达和Erk1/2信号通路的激活调控乳腺癌的增殖和侵袭。结论:1、成功鉴定到与Anxa2相互作用的蛋白质组,并对其进行了 GO、COG和pathway功能分析和初步筛选,进一步解析了相互作用的网络。2、证实了 Ebp1为Anxa2一个新的相互作用蛋白,降表达Ebp1的蛋白水平使得乳腺癌细胞的增殖和侵袭能力增强,同时伴随着Anxa2蛋白表达水平以及活性水平的增强,说明Ebp1是乳腺癌细胞增殖和侵袭的负向调控因子。3、Ebp1对乳腺癌的负调控作用可能通过调控周期相关蛋白cyclinD1的表达以及Erk1/2通路的激活实现。