论文部分内容阅读
目的:探讨Rho激酶(ROCK)抑制剂法舒地尔(Fas)对压力超负荷性心肌肥厚(POH)的作用及其作用机制。方法:1模型制备及给药采用腹主动脉缩窄术制备大鼠POH模型。60只雄性Wistar大鼠,体重200～220 g,随机分为5组:假手术组、POH模型组、Fas低剂量组(L-Fas,2 mg/kg/d)、Fas高剂量组(H-Fas,10 mg/kg/d)及阳性对照药卡托普利组(Captopril),每组12只。除假手术组外,其余4组大鼠均行肾上方腹主动脉缩窄术制备POH模型。假手术组仅分离腹主动脉而不结扎。术后4 w成功建立POH模型并开始给药,疗程为4 w。2指标检测实验过程中密切观察动物的一般状况。停药24 h后,进行以下指标的检测:(1)每组随机取6只大鼠进行血流动力学检测;(2)将各组中剩余6只大鼠称取体重(BW)后断头取血,检测血清超氧化物歧化酶(SOD)和一氧化氮合酶(NOS)的活性、血清丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)、血浆内皮素(ET-1)的水平;(3)取血完毕,迅速取出心脏,清除血迹,滤纸吸干,称取心脏重量(HW)和左心室重量(LVW),计算心脏重量指数(HWI)和左心室重量指数(LVWI);(4)从已称取LVW的左心室取部分心肌组织,4%多聚甲醛固定24 h,梯度酒精脱水,石蜡包埋,连续切片,分别进行HE染色以观察心肌的病理学改变并测量心肌细胞直径(CMD)和Masson染色以观察心肌间质的胶原改变并测定心肌胶原百分比(CVF);(5)血流动力学检测完毕,以4%多聚甲醛行心脏灌注固定,然后取部分左心室肌组织,采用免疫组织化学法检测各组大鼠心肌组织中凋亡相关基因Bax、Bcl-2、c-fos和c-myc的表达,并计算Bcl-2/Bax的比值;(6)迅速从已称取LVW的左心室取部分心肌组织液氮冻存,采用半定量RT-PCR法检测各组大鼠心肌组织中RhoA mRNA和ROCK mRNA的表达变化。结果:1大鼠一般状态假手术组大鼠一般状况良好,与术前未见明显差别。而接受腹主动脉缩窄术的大鼠术后1 w与术前比较,一般状况较差,精神萎靡,活动量减少,摄食及饮水量减少;1 w后至实验结束,POH组大鼠一般状况始终较差,而Fas治疗组和阳性对照组大鼠的一般状况较POH组有明显改善。各组大鼠均未出现呼吸困难、水肿、尿少等心衰症状。药物干预后未见动物死亡。2血流动力学变化与假手术组比较,POH组的LVSP和LVEDP明显增加(P<0.01),而±dp/dtmax显著下降(P<0.01)。与POH组相比,L-Fas组、H-Fas组和阳性对照组的LVSP和LVEDP均显著下降(P<0.01),而±dp/dtmax明显升高(P<0.01)。3血液生化指标的测定与假手术组比较,POH组的NO含量及NOS和SOD的活性显著降低(P<0.01),而ET-1和MDA含量升高(P<0.01);与POH组比较,L-Fas组的NO含量升高,而ET-1含量下降(分别为P<0.01和P<0.05),该组的NOS和SOD活性有所升高,MDA含量有所下降,但均无统计学意义;H-Fas组和阳性对照组的NOS和SOD的活性显著增强,NO含量显著升高,而MDA和ET-1含量明显减少(P<0.01)。4心脏重量指数的测定与假手术组比较,POH组的HW、LVW、HWI和LVWI均显著增大(P<0.01)。与POH组比较,L-Fas组、H-Fas组和阳性对照组的HW有不同程度的降低(分别为P<0.05、P<0.01和P<0.01);L-Fas组、H-Fas组及阳性对照组的LVW、HWI和LVWI均显著减小(P<0.01)。5病理学检测HE染色显示:假手术组大鼠的心肌结构清晰,形态未见明显异常;而POH组可见心肌细胞明显肥大,细胞核亦明显增大变圆,心肌细胞排列紊乱,肌丝纹理增粗;L-Fas组、H-Fas组和阳性对照组的心肌损害程度明显轻于POH组。Masson染色显示,与假手术组相比,POH组心肌间质内胶原含量显著增加,纤维化明显加重;而L-Fas组、H-Fas组和阳性对照组的心肌纤维化程度较POH组明显改善。与假手术组比较,POH大鼠的CMD和心肌CVF显著升高(P<0.01)。与POH组比较,L-Fas组、H-Fas组及阳性对照组的CMD不同程度地减小(分别为P<0.05、P<0.01和P<0.01);H-Fas组及阳性对照组的心肌CVF明显下降(P<0.01)。6凋亡相关基因的表达与假手术组比较,POH组心肌组织中Bax、c-fos和c-myc的表达显著增强(P<0.01),Bcl-2的表达明显下降(P<0.01),Bcl-2/Bax的比值下降(P<0.01)。与POH组比较,L-Fas组的c-fos的表达明显下降(P<0.05),Bax和c-myc的表达均有所下降,Bcl-2表达有所上调,但无统计学意义;H-Fas组和阳性对照组的Bax、c-fos和c-myc明显下降(P<0.01),Bcl-2的表达水平显著升高(P<0.01);经Fas或卡托普利治疗后,Bcl-2/Bax的比值显著升高(分别为P<0.05、P<0.01和P<0.01)。7 RhoA mRNA和ROCK mRNA的表达与假手术组比较,POH组的RhoA mRNA和ROCK mRNA的表达明显上调(P<0.01)。与POH组比较,L-Fas组和H-Fas组的RhoA mRNA和ROCK mRNA表达不同程度地下调(分别为P<0.05和P<0.01);阳性对照组的RhoA mRNA和ROCK mRNA表达亦显著下调(P<0.01)。结论:RhoA/ROCK信号转导途径在POH的发生与发展中起着重要作用。ROCK抑制剂Fas可以有效地抑制POH,保护POH大鼠的心功能,这种作用可能与以下因素有关:(1)增强NOS的活性,促进NO的生成,抑制潜在的心肌细胞生长因子和肥厚因子ET-1的生成,进而抑制心肌纤维化和心肌重构;(2)提高SOD的活性,增强心肌的抗氧化能力,减少MDA的生成,阻止心肌肥厚的发生与发展;(3)降低HWI和LVWI,抑制心肌细胞肥大和心肌间质内胶原的合成,减轻心肌纤维化和心肌重构;(4)抑制凋亡促进因子Bax、c-fos和c-myc的表达,而促进凋亡抑制因子Bcl-2的表达,进而升高Bcl-2/Bax的比值,抑制细胞凋亡,并调节由这些原癌基因介导的信号传递过程,抑制心肌细胞肥大和心肌纤维化。