基于TMT研究NAC对妊娠早期山羊子宫蛋白表达的影响

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雌性动物子宫在早期胚胎着床、胎儿宫内发育以及胎盘的发育过程中发挥重要的作用。大量研究证明N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)在动物生殖生理调控、胚胎发育以及抑制炎症等方面的有效性,具有较大的研究价值。课题组前期在妊娠早期母羊的日粮中添加不同浓度NAC,发现日粮中添加0.07%NAC对母羊产羔率较0.03%NAC、0.05%NAC、0.09%NAC有更好的效果,且通过RNA-Seq技术探究了NAC影响母羊子宫角m RNA表达的差异,从转录水平上提出了NAC影响妊娠早期母羊子宫角的差异表达基因。基于此,为深入研究NAC参与母羊早期妊娠调控的内在机制,本研究以黔北麻羊为研究对象,通过在妊娠早期日粮中添0.07%NAC,从母羊生殖激素分泌规律、抗氧化指标含量变化以及子宫角蛋白质表达谱差异等来研究NAC对母羊早期妊娠调控可能产生的影响。主要研究结果如下:1、利用同期排卵-定时输精方案对60只试验母羊处理后,随机分组,试验组(基础日粮+0.07%NAC),对照组(基础日粮)。数据统计分析发现:应用孕酮阴道海绵栓+PMSG+PG处理母羊,其同期发情率达88.33%。试验组较对照组能够提高山羊的产羔率和受胎率。组间不同妊娠天数(0d、3d、7d、21d、30d、35d)母羊血清中生殖激素及生化指标含量检测结果表明:试验组和对照组母羊血清中相应生殖激素(E2、P4、FSH、LH)和抗氧化指标(SOD、GSH-Px)以及NO的含量有相应的变化。HE染色结果显示:妊娠早期母羊日粮中添加0.07%NAC对输卵管和子宫角的形态结构无明显影响。2、体外分离、鉴定得到山羊子宫内膜基质细胞,通过在细胞培养液中加入不同浓度梯度的NAC,探究NAC对细胞增殖及相关基因表达的影响。细胞增殖测定发现200μmol·L-1的NAC浓度促进细胞增殖的作用最为显著。在基因m RNA表达水平也发生相应变化,200μmol·L-1的NAC添加较空白对照组分别极显著(p<0.01)和显著(p<0.05)降低细胞中TGF-β1、TGF-β3基因m RNA的表达水平。极显著提高细胞周期相关因子Cyclin A1和Cyclin E基因m RNA的表达水平(p<0.01)。并极显著降低Cyclin D2基因的表达(p<0.01),同时极显著提高了增殖细胞核抗原PCNA的m RNA表达水平(p<0.01),这提示NAC添加对细胞的增殖有促进作用。3、为了探究0.07%NAC添加对母羊子宫角蛋白质表达谱的影响,利用TMT定量蛋白质组学和生物信息学分析、挖掘NAC参与母羊早期妊娠调控的差异蛋白质和关键信号通路。通过质谱定量检测,一共定量蛋白质6258个,其中差异表达蛋白质125个,与对照组相比,试验组上调蛋白质47个,下调蛋白质78个。对差异表达蛋白(Differentially Expressed Proteins,DEPs)进行生物信息学分析发现DEPs主要参与蛋白质磷酸化、细胞内蛋白质运输、氧化-还原过程、氨基酸跨膜运输、代谢过程、翻译、类固醇激素合成的信号传导途径。主要分布于细胞核、膜成分、核糖体。主要与酶活性(包括转移酶、蛋白激酶、水解酶、抗氧化物酶),和过渡金属离子结合以及特异性序列DNA结合等相关。KEGG通路分析显示,这些被鉴定的DEPs参与了53条通路,一些丰富的KEGG通路参与到紧密连接、氧化磷酸化过程、酪氨酸激酶-转录激活蛋白信号通路(JAK-STAT signaling pathway)信号传送途径、氨基酸和类固醇激素的生物合成等途径。4、TMT定量蛋白质组学筛选得到了日粮中添加0.07%NAC影响母羊子宫角差异表达的蛋白质。通过q RT-PCR、IHC、Western blot实验技术对筛选得到的差异表达蛋白PELO、GFAP的蛋白定位及组织表达水平进行验证。结果显示:上调蛋白编码基因m RNA表达量在试验组均高于对照组,下调蛋白编码基因m RNA表达量在试验组均低于对照组;免疫组化分析发现PELO、GFAP蛋白定位于山羊子宫内膜细胞,在子宫基质细胞中也有分布。蛋白印迹对PELO和GFAP蛋白的表达进行验证,上调蛋白PELO在子宫角组织表达量为试验组均高于对照组,下调蛋白GFAP在子宫角组织表达量为试验组均低于对照组,结果与测序结果一致。综上,本研究检测了山羊妊娠早期激素及血液指标,分析了饲喂NAC改善山羊产羔性能的原因。向体外培养子宫内膜基质细胞添加200μmol·L-1 NAC改善了子宫内膜增殖相关基因表达;利用TMT定量蛋白组学方法,研究了饲喂NAC后山羊的子宫角差异蛋白,并从转录和蛋白水平验证了蛋白表达差异,为后续探索NAC提高山羊繁殖性能机理研究奠定了工作基础。
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