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背景冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary atherosclerotic heart disease,CHD)是一种严重危害人类健康的疾病,动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是其基本病理改变。随着现代医学的不断进步,对于AS机制的研究也十分广泛,AS的发生与发展过程涉及炎症、免疫、内皮功能、凝血、神经-内分泌调节等多个环节,如何在早期对AS进行防治是一个重要命题。中医药从整体观念出发,对冠心病的病因病机认识有深刻的认识,在防治AS方面也有独特的优势。导师王显教授在冠心病气虚血瘀理论的基础上,结合多年临床经验,创新性提出冠心病“络风内动”病机学说,认为冠心病具有迁延反复、变化多端的发病特点,与“风邪”致病特点相契合,并提出祛风通络法是治疗冠心病的重要治法治则。根据“络风内动”理论,王显教授创制了“络风宁”系列方,络风宁1号方由徐长卿、地龙、黄芪、三七和冰片组成,临床研究证实络风宁1号方对改善冠心病心绞痛有确切疗效。前期实验证明,络风宁1号方具有抗炎、调节血脂、改善血管内皮功能等作用。AS是CHD的基本病理改变,其本质是一种慢性炎症反应,适应性免疫调节在AS发生发展过程中发挥着重要的作用。树突状细胞(dendritic cell,DC)是一种功能强大的抗原提呈细胞,在抗原的刺激下免疫成熟,通过抗原提呈作用活化T细胞,促进T细胞增殖分化,释放炎症因子,介导适应性免疫调节。活化后的T细胞和炎症因子能够刺激巨噬细胞的生成和募集,进而形成泡沫细胞,促进AS 的进程。氧化低密度脂蛋白(oxidizedlow density lipoprotein,ox-LDL)是 AS中的重要抗原,在适应性免疫过程中,它可以和DC表面清道夫受体结合,促进DC免疫活化。Janus 激酶(Januskinase,JAK)/信号转导子和转录激活子(signaltransducer andactivatoroftranscription,STAT)/细胞因子信号转导抑制因子(suppressorsof cytokine signaling,SOCS)信号通路是多种炎症因子共同的下游信号通路,该信号通路的激活与DC的免疫活化有密切关系。在多种免疫相关性疾病中,DC的免疫功能被激活且DC中的JAK/STAT/SOCS信号通路也处于被激活状态,JAK抑制剂则能够通过抑制JAK/STAT/SOCS信号通路减弱DC的免疫活化,进而抑制DC介导的适应性免疫调节。JAK/STAT/SOCS信号通路的激活与动脉粥样硬化也有着密切的关系。在多种动脉粥样硬化模型中,JAK/STAT信号通路处于被激活状态。JAK抑制剂则可以减弱动脉粥样硬化的程度,并减弱相关的炎症反应。本实验选择DC作为研究对象,建立体外DC培养体系,使用ox-LDL诱导DC免疫成熟,用络风宁1号方对DC的成熟过程进行干预,探索其对DC免疫功能的影响和对JAK/STAT/SOCS信号通路的影响,阐明络风宁1号方抗AS的分子机制,为中医药防治心血管疾病的研究提供新的思路和方法。目的1.对现有的从风论治冠心病的临床研究文献进行Meta分析,探讨从风论治冠心病的有效性,为冠心病络风内动病机学说提供临床依据,并为该学说的进一步发展提供一定的参考。2.通过研究络风宁1号方对DC的免疫功能影响及对DC中JAK/STAT/SOCS信号通路的影响,探索络风宁1号方对DC免疫功能的影响及可能机制,为中医药防治心血管病提供新思路。方法1.从文献分析的角度探索从风论治冠心病的有效性在中英文数据库中检索已发表的从风论治冠心病的临床随机对照研究实验(randomized controlled trial,RCT),筛选出符合标准的文献进行Meta分析。对纳入荟萃分析的文献进行数据提取和质量评估。将提取的数据用RevMan5.3软件进行数据分析,主要终点为总有效率(心绞痛疗效),次要终点包括心电图疗效、中医症候疗效、血脂水平及高敏C反应蛋白(high sensitivity c-reactive protein,hs-CRP)。最后用漏斗图评估发表偏倚。2.DC的制备和培养采集健康志愿者的外周血,用密度梯度离心法和免疫磁珠分选法,得到DC前体——CD14+单核细胞,CD14+单核细胞在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage-colony stimulating factor,GM-CSF)和白介素 4(interleukin 4,IL-4)共同作用下分化为未成熟的DC。3.ox-LDL诱导DC免疫成熟的条件与DC的鉴定用CCK-8法筛选ox-LDL对DC细胞活力影响较小的浓度范围和作用时间,流式细胞术检测DC表面标记分子的表达情况,探索出ox-LDL促进DC成熟的最佳作用条件,同时也可以用作鉴定DC的成熟。4.络风宁1号方对DC活力的影响制备络风宁1号方含药血清,按照12倍于人的公斤体重用药量将络风宁1号方给大鼠灌胃,7天后腹主动脉取血,留取血清备用。用CCK-8法探索JAK抑制剂鲁索替尼和大鼠血清对DC细胞活力的影响,筛选鲁索替尼和络风宁1号方含药血清干预DC的适合条件。5.络风宁1号方对DC免疫功能的影响将DC分为6组:空白组、模型组、鲁索替尼组、络风宁1号方高浓度组(20%含药血清)、络风宁1号方中浓度组(10%含药血清)和络风宁1号方低浓度组(5%含药血清)组。分组干预后的DC与T细胞共培育,Elisa法检测上清中多种炎症细胞因子的水平,探索络风宁1号方对DC活化T细胞能力的影响。用Western Blot法检测DC中ox-LDL受体凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1(lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1,LOX-1)和 CD36 蛋白表达,RT-PCR检测DC中LOX-1和CD36 mRNA的表达,评价络风宁1号方对DC应答ox-LDL的影响。6.络风宁1号方对DC中JAK/STAT/SOCS信号通路的影响实验分组同上,用Western Blot法检测DC中JAK/STAT/SOCS信号通路相关蛋白表达,RT-PCR检测JAK/STAT/SOCS信号通路相关mRNA的表达,探索络风宁1号方对JAK/STAT/SOCS信号通路的影响。将络风宁1号方组结果与JAK抑制剂组结果进行比较,探索络风宁1号方影响DC免疫功能的可能机制。结果1.从文献分析的角度探索从风论治冠心病的有效性文献筛选后共纳入25篇从风论治冠心病的RCT研究文献。Meta分析结果提示:①与对照组相比,使用具有祛风效果的中药对冠心病进行治疗,在总有效率(心绞痛疗效)、心电图疗效、中医症候疗效方面有明显优势(P<0.05),在改善炎症指标hs-CRP方面有明显优势(P<0.05),在改善血脂指标总胆固醇(total cholesterol,TC)、总甘油三酯(total triglycerides,TG)和低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)方面有一定疗效(P<0.05),但对高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)的影响不明显(P>0.05)。2.DC的制备和培养外周血来源的CD14+单核细胞经过6天的培养后分化为未成熟的DC,显微镜下观察细胞形态。D1:细胞呈圆形,体积较小。D3,细胞呈集落样聚集,体积逐渐增大,部分细胞表面可见毛刺样凸起。D6:细胞体积明显增大,集落样聚集减少,表面可见许多毛刺样凸起。3.ox-LDL诱导DC免疫成熟的条件与DC的鉴定从CCK-8结果和DC表面流式分子的检测结果,选择100 μg/mL的ox-LDL干预24h作为造模条件。流式细胞术检测结果显示,与空白组相比,ox-LDL作用于DC后,DC表面CD1a、CD80、CD86和HLA-DR表达升高,提示ox-LDL可促进DC免疫成熟。4.络风宁1号方对DC活力的影响CCK-8法检测不同浓度络风宁1号方和鲁索替尼对DC活力的影响,筛选出鲁索替尼作用于DC的浓度为0.1μmol/L,大鼠血清作用于DC的浓度为20%。5.络风宁1号方对DC免疫功能的影响Elisa法检测各组DC与T细胞共培育48h后的细胞上清,结果显示:与空白组相比,ox-LDL干预后的DC可以明显活化T细胞,促进细胞因子IL-4、IFN-γ、IL-6、IL-17A的分泌(P<0.05)。与模型组相比,鲁索替尼组DC和络风宁1号方组DC与T细胞共培育的细胞上清中,前述细胞因子水平均有不同程度减低(P<0.05),提示络风宁1号方和鲁索替尼均能降低DC活化T细胞的功能。Western blot和RT-PCR结果显示,与空白组相比,ox-LDL可以明显上调LOX-1和CD36的蛋白表达和基因表达;与模型组相比,络风宁1号方组和鲁索替尼组均可以下调LOX-1和CD36的蛋白表达和基因表达,提示络风宁1号方和鲁索替尼均能减弱DC对ox-LDL的应答。6.络风宁1号方对DC中JAK/STAT/SOCS信号通路的影响Western blot和RT-PCR结果显示,与空白组相比,ox-LDL可以明显上调JAK1/2和STAT3的蛋白和基因表达,促进p-STAT3水平,下调SOCS1的蛋白和基因表达;与模型组相比,络风宁1号方中、高浓度组和鲁索替尼组均可以下调JAK1/2和STAT3的蛋白和基因表达,减弱STAT3磷酸化,上调SOCS1的蛋白和基因表达。提示络风宁1号方和鲁索替尼均可以抑制JAK/STAT信号通路,激活SOCS1的负反馈调节。结论1.相关文献荟萃分析显示,在结合西药基础治疗的情况下,从风论治冠心病可以取得更好的临床疗效,且在改善心绞痛疗效、心电图疗效、中医症候疗效、血脂水平和降低hs-CRP等方面有更好的作用。2.Ox-LDL可以促进DC的免疫成熟,络风宁1号方可以减弱DC活化T细胞的能力,减少炎症因子的分泌,减弱DC对ox-LDL的应答,进而抑制DC的免疫活化。3.Ox-LDL可以激活DC中的JAK/STAT信号通路,抑制SOCS1的负反馈调节,而络风宁1号方可以抑制JAK/STAT信号通路,激活SOCS负反馈调节。络风宁1号方对DC的影响作用与JAK抑制剂相似,提示络风宁1号方可能通过抑制JAK/STAT信号通路,并激活SOCS1的负反馈调节,对DC的免疫功能进行调节。