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目的：高效的肿瘤疫苗必须具备两个条件：一个是含有肿瘤抗原，另一个是能够激活合适的天然免疫信号。实验室前期研究发现，肿瘤细胞来源的微颗粒(T-MP)依赖树突状细胞(DC)能够诱导肿瘤特异性T细胞反应，提示其具备作为肿瘤疫苗的潜力。课题组进一步研究发现，肿瘤微颗粒被DC摄取后，定位于溶酶体，不仅使溶酶体的pH值增加以有利于肿瘤抗原的加工，还同时上调共刺激分子CD80/86的表达，进而有效的刺激特异性抗肿瘤T细胞应答。因此，本研究将围绕肿瘤细胞来源的微颗粒如何调节DC溶酶体的pH值以及CD80/86上调表达的分子机制进行探索。回答这些基本问题，有望揭示肿瘤微颗粒作为肿瘤疫苗的具体机理，为新型高效肿瘤疫苗的开发奠定理论基础。
方法：
1.DC活化的检测：将OVA-MP和成熟的BMDCs共孵育一定时间后，通过流式细胞术检测CD80/86、CCR7、MHC-I/II、CD40、OX40L以及PD-L1的表达。
2.DC摄取OVA-MP的方式以及定位：将用PKH-26/PKH67标记的OVA-MP和成熟的BMDCs共孵育一定时间后，分别对其线粒体，内质网，高尔基体，早期内吞体，晚期内吞体，溶酶体进行荧光标记，在双光子共聚焦显微镜下观察它们与OVA-MP的定位情况。
3.DC溶酶体pH值的检测：将OVA-MP和成熟的BMDCs共孵育，在0hr、1hr、3hr、6hr、12hr、24hr和48hr等不同时间点收集BMDCs分别用Lyso-SensorGreenDND-189和Lyso-SensorYellow/BlueDND-160荧光染料进行染色，采用共聚焦显微镜和酶标仪对溶酶体pH值进行定性和定量检测；用NOX2抑制剂Diphenyleneiodonium(DPI)或者其siRNA处理BMDCs后，分析加入OVA-MP处理一定时间后溶酶体的pH值。
4.溶酶体相关蛋白检测：将OVA-MP和成熟的BMDCs共孵育，在3hr、6hr、12hr、24hr和48hr等不同时间点采用Real-timePCR和Westernblot方法分析BMDCs的LAMP1、LAMP2、调控溶酶体生成的转录因子TFEB、质子泵V-ATPase的各个亚基(ATP6V0A1、ATP6V0A2、ATP6V0C、ATP6V0E、ATP6V1A、ATP6V1B2、ATP6V1C1、ATP6V1E1、ATP6V1F、ATP6V1G1、ATP6V1H)和NOX2的表达情况。
5.NOX2在DC溶酶体上的募集以及活化的检测：采用共聚焦检测OVA-MP处理前后gp91phox在BMDCs的亚细胞定位；将OVA-MP和成熟的BMDCs共孵育不同时间后，采用流式细胞术以及共聚焦检测ROS的产生；采用siRNAgp91或者DPI处理BMDCs后，再检测ROS的产生。
6.钙离子通道以及钙离子浓度检测：采用Real-timePCR检测OVA-MP对BMDCs溶酶体膜表面钙离子通道如TPC1/2以及Mcoln1/2的表达的影响；将BMDCs的溶酶体使用Lyso-TrackerRedDND-99进行染色，同时对BMDCs内钙离子用绿色荧光钙指示剂Fluo-4AM进行标记，之后加入OVA-MP处理2hr，在共聚焦显微镜下持续观察溶酶体内外钙离子浓度的变化；采用抑制剂CGP37157和ryanodine阻断线粒体或内质网钙离子的释放，再检测OVA-MP对BMDCs钙离子释放的影响。
7.DC中TFEB的定位，表达以及其对CD80/86的调控的检测：用OVA-MP处理BMDCs不同时间点后收集细胞。通过免疫荧光以及Westernblot检测TFEB的定位以及表达情况；采用siRNA敲降TFEB或者通过CHIP实验检测其对CD80/86的调控。
8.DC抗原提呈能力的检测：用OVA-MP处理BMDCs一定时间后，收集细胞检测OVA(257-264)的表达以及OVA特异性CD8+T细胞的增殖情况；采用DPI，NAC或者NOX2的siRNA处理BMDCs后，再用OVA-MP处理BMDCs一定时间后，收集细胞检测OVA(257-264)肽的表达以及OVA特异性CD8+T细胞的增殖情况。
结果：
1.流式检测结果显示：OVA-MP能显著上调BMDCs的CD80/86、CCR7、MHC-I/II、CD40以及OX40L的表达，但却对PD-L1无明显影响，这说明OVA-MP能促进DC的活化。
2.共定位结果显示：OVA-MP没有和BMDCs的线粒体，内质网以及高尔基体共定位，而是和其早期内吞体，晚期内吞体以及溶酶体共定位。这说明DC是以经典的内吞途径将OVA-MP摄入细胞内，并最终定位在溶酶体。
3.通过共聚焦显微镜和酶标仪对溶酶体的pH值进行定性和定量检测，结果显示：负载OVA-MP的BMDCs的溶酶体的pH值显著上升，并且在24hr内达到8.5这个峰值。免疫荧光结果显示：用DPI或者NOX2siRNA处理负载OVA-MP的BMDCs后，BMDCs的溶酶体pH值升高的现象被抑制。这说明了溶酶体pH值的升高是NOX2介导的。
4.OVA-MP处理BMDCs一定时间后，Real-timePCR以及Westernblot结果显示：BMDCs的溶酶体相关基因LAMP1、LAMP2以及TFEB都上调表达，说明OVA-MP对BMDCs溶酶体的形成有影响。同时Real-timePCR检测结果显示：OVA-MP对BMDCs的V-ATPase的各个亚基没有显著影响，却显著上调NOX2的表达。这进一步表明OVA-MP使BMDCs的溶酶体pH值升高是NOX2介导的，而不是V-ATPase。
5.免疫荧光共定位结果显示：负载OVA-MP的BMDCs其NOX2被有效的募集到溶酶体，并且免疫荧光共聚焦结果以及流式结果也都表明：负载OVA-MP的BMDCs其ROS产生增多，而采用siRNA或DPI敲降或抑制BMDCs的NOX2后，明显抑制了ROS的产生。这说明使BMDCs溶酶体pH值升高是NOX2产生的ROS介导的。
6.Real-timePCR结果显示：负载OVA-MP的BMDCs其钙离子通道蛋白Mcoln2显著上调表达；通过免疫荧光实时拍照检测发现负载OVA-MP的BMDCs其钙离子更多的释放出来。分别采用抑制剂抑制线粒体以及内质网的钙离子的释放后，发现这并不影响负载OVA-MP的BMDCs其钙离子的释放。这说明OVA-MP使BMDCs溶酶体的钙离子释放增加。
7.免疫荧光以及Westernblot实验结果显示：经OVA-MP处理后，BMDCs中的TFEB大量转移到细胞核中，并且我们敲降TFEB后，发现BMDCs的CD80/CD86都下调表达，同时通过Chip-qPCR发现TFEB结合在CD80/CD86的启动子区，并调控其表达。这说明在负载OVA-MP的BMDCs中，TFEB调控CD80/CD86的表达。
8.流式分析结果显示：负载OVA-MP的BMDCs能将MHC-I/OVA肽表达在其表面，并且和OT-ICD8+T细胞共孵育后，能很好的使T细胞增殖。这说明BMDCs能有效的处理和提呈OVA-MP来源的肿瘤抗原给T细胞。当我们阻断或者敲降NOX2后，发现T细胞增殖以及MHC-I/OVA肽的提呈受到显著抑制，并且我们进一步用NAC清除ROS后，T细胞增殖也受到显著抑制。这说明负载OVA-MP的BMDCs是通过NOX2产生的ROS进而使溶酶体的pH值增加，最后导致DC产生有效的MHC-肿瘤抗原肽并提呈给T细胞，促进其增值，发挥杀伤肿瘤的作用。
结论：
DC通过经典的内吞作用将肿瘤细胞来源的微颗粒摄取到溶酶体，进而肿瘤细胞来源的微颗粒通过NOX2催化产生的ROS显著增加溶酶体的pH值。pH值的增加以伴随着肿瘤细胞来源的微颗粒驱动的溶酶体向心迁移，共同促进了MHCI类分子-肿瘤抗原肽复合物的形成。同时，内吞的肿瘤细胞来源的微颗粒导致BMDCs的CD80/CD86上调表达。肿瘤细胞来源的微颗粒通过NOX2催化产生的ROS激活溶酶体Ca2+通道Mcoln2，导致Ca2+释放。释放的Ca2+激活TFEB。TFEB是一种溶酶体的管家基因，它可以直接结合在CD80/CD86启动子区进而促进CD80/86的表达。
方法：
1.DC活化的检测：将OVA-MP和成熟的BMDCs共孵育一定时间后，通过流式细胞术检测CD80/86、CCR7、MHC-I/II、CD40、OX40L以及PD-L1的表达。
2.DC摄取OVA-MP的方式以及定位：将用PKH-26/PKH67标记的OVA-MP和成熟的BMDCs共孵育一定时间后，分别对其线粒体，内质网，高尔基体，早期内吞体，晚期内吞体，溶酶体进行荧光标记，在双光子共聚焦显微镜下观察它们与OVA-MP的定位情况。
3.DC溶酶体pH值的检测：将OVA-MP和成熟的BMDCs共孵育，在0hr、1hr、3hr、6hr、12hr、24hr和48hr等不同时间点收集BMDCs分别用Lyso-SensorGreenDND-189和Lyso-SensorYellow/BlueDND-160荧光染料进行染色，采用共聚焦显微镜和酶标仪对溶酶体pH值进行定性和定量检测；用NOX2抑制剂Diphenyleneiodonium(DPI)或者其siRNA处理BMDCs后，分析加入OVA-MP处理一定时间后溶酶体的pH值。
4.溶酶体相关蛋白检测：将OVA-MP和成熟的BMDCs共孵育，在3hr、6hr、12hr、24hr和48hr等不同时间点采用Real-timePCR和Westernblot方法分析BMDCs的LAMP1、LAMP2、调控溶酶体生成的转录因子TFEB、质子泵V-ATPase的各个亚基(ATP6V0A1、ATP6V0A2、ATP6V0C、ATP6V0E、ATP6V1A、ATP6V1B2、ATP6V1C1、ATP6V1E1、ATP6V1F、ATP6V1G1、ATP6V1H)和NOX2的表达情况。
5.NOX2在DC溶酶体上的募集以及活化的检测：采用共聚焦检测OVA-MP处理前后gp91phox在BMDCs的亚细胞定位；将OVA-MP和成熟的BMDCs共孵育不同时间后，采用流式细胞术以及共聚焦检测ROS的产生；采用siRNAgp91或者DPI处理BMDCs后，再检测ROS的产生。
6.钙离子通道以及钙离子浓度检测：采用Real-timePCR检测OVA-MP对BMDCs溶酶体膜表面钙离子通道如TPC1/2以及Mcoln1/2的表达的影响；将BMDCs的溶酶体使用Lyso-TrackerRedDND-99进行染色，同时对BMDCs内钙离子用绿色荧光钙指示剂Fluo-4AM进行标记，之后加入OVA-MP处理2hr，在共聚焦显微镜下持续观察溶酶体内外钙离子浓度的变化；采用抑制剂CGP37157和ryanodine阻断线粒体或内质网钙离子的释放，再检测OVA-MP对BMDCs钙离子释放的影响。
7.DC中TFEB的定位，表达以及其对CD80/86的调控的检测：用OVA-MP处理BMDCs不同时间点后收集细胞。通过免疫荧光以及Westernblot检测TFEB的定位以及表达情况；采用siRNA敲降TFEB或者通过CHIP实验检测其对CD80/86的调控。
8.DC抗原提呈能力的检测：用OVA-MP处理BMDCs一定时间后，收集细胞检测OVA(257-264)的表达以及OVA特异性CD8+T细胞的增殖情况；采用DPI，NAC或者NOX2的siRNA处理BMDCs后，再用OVA-MP处理BMDCs一定时间后，收集细胞检测OVA(257-264)肽的表达以及OVA特异性CD8+T细胞的增殖情况。
结果：
1.流式检测结果显示：OVA-MP能显著上调BMDCs的CD80/86、CCR7、MHC-I/II、CD40以及OX40L的表达，但却对PD-L1无明显影响，这说明OVA-MP能促进DC的活化。
2.共定位结果显示：OVA-MP没有和BMDCs的线粒体，内质网以及高尔基体共定位，而是和其早期内吞体，晚期内吞体以及溶酶体共定位。这说明DC是以经典的内吞途径将OVA-MP摄入细胞内，并最终定位在溶酶体。
3.通过共聚焦显微镜和酶标仪对溶酶体的pH值进行定性和定量检测，结果显示：负载OVA-MP的BMDCs的溶酶体的pH值显著上升，并且在24hr内达到8.5这个峰值。免疫荧光结果显示：用DPI或者NOX2siRNA处理负载OVA-MP的BMDCs后，BMDCs的溶酶体pH值升高的现象被抑制。这说明了溶酶体pH值的升高是NOX2介导的。
4.OVA-MP处理BMDCs一定时间后，Real-timePCR以及Westernblot结果显示：BMDCs的溶酶体相关基因LAMP1、LAMP2以及TFEB都上调表达，说明OVA-MP对BMDCs溶酶体的形成有影响。同时Real-timePCR检测结果显示：OVA-MP对BMDCs的V-ATPase的各个亚基没有显著影响，却显著上调NOX2的表达。这进一步表明OVA-MP使BMDCs的溶酶体pH值升高是NOX2介导的，而不是V-ATPase。
5.免疫荧光共定位结果显示：负载OVA-MP的BMDCs其NOX2被有效的募集到溶酶体，并且免疫荧光共聚焦结果以及流式结果也都表明：负载OVA-MP的BMDCs其ROS产生增多，而采用siRNA或DPI敲降或抑制BMDCs的NOX2后，明显抑制了ROS的产生。这说明使BMDCs溶酶体pH值升高是NOX2产生的ROS介导的。
6.Real-timePCR结果显示：负载OVA-MP的BMDCs其钙离子通道蛋白Mcoln2显著上调表达；通过免疫荧光实时拍照检测发现负载OVA-MP的BMDCs其钙离子更多的释放出来。分别采用抑制剂抑制线粒体以及内质网的钙离子的释放后，发现这并不影响负载OVA-MP的BMDCs其钙离子的释放。这说明OVA-MP使BMDCs溶酶体的钙离子释放增加。
7.免疫荧光以及Westernblot实验结果显示：经OVA-MP处理后，BMDCs中的TFEB大量转移到细胞核中，并且我们敲降TFEB后，发现BMDCs的CD80/CD86都下调表达，同时通过Chip-qPCR发现TFEB结合在CD80/CD86的启动子区，并调控其表达。这说明在负载OVA-MP的BMDCs中，TFEB调控CD80/CD86的表达。
8.流式分析结果显示：负载OVA-MP的BMDCs能将MHC-I/OVA肽表达在其表面，并且和OT-ICD8+T细胞共孵育后，能很好的使T细胞增殖。这说明BMDCs能有效的处理和提呈OVA-MP来源的肿瘤抗原给T细胞。当我们阻断或者敲降NOX2后，发现T细胞增殖以及MHC-I/OVA肽的提呈受到显著抑制，并且我们进一步用NAC清除ROS后，T细胞增殖也受到显著抑制。这说明负载OVA-MP的BMDCs是通过NOX2产生的ROS进而使溶酶体的pH值增加，最后导致DC产生有效的MHC-肿瘤抗原肽并提呈给T细胞，促进其增值，发挥杀伤肿瘤的作用。
结论：
DC通过经典的内吞作用将肿瘤细胞来源的微颗粒摄取到溶酶体，进而肿瘤细胞来源的微颗粒通过NOX2催化产生的ROS显著增加溶酶体的pH值。pH值的增加以伴随着肿瘤细胞来源的微颗粒驱动的溶酶体向心迁移，共同促进了MHCI类分子-肿瘤抗原肽复合物的形成。同时，内吞的肿瘤细胞来源的微颗粒导致BMDCs的CD80/CD86上调表达。肿瘤细胞来源的微颗粒通过NOX2催化产生的ROS激活溶酶体Ca2+通道Mcoln2，导致Ca2+释放。释放的Ca2+激活TFEB。TFEB是一种溶酶体的管家基因，它可以直接结合在CD80/CD86启动子区进而促进CD80/86的表达。