四君子汤联合奥沙利铂对结肠癌荷瘤小鼠及NK细胞影响的机制研究

来源 :上海中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:liongliong481
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目的:本论文欲验证四君子汤是否可以降低奥沙利铂毒性,减少对NK细胞的抑制,改善NK细胞活性,增强肿瘤免疫反应。课题组前期研究表明四君子汤能增加荷瘤小鼠瘤体中NK细胞数量和活化NK细胞的比例,并降低荷瘤小鼠的瘤体体积以及转移瘤发生率。本论文通过建立NK细胞共培养模型,结肠癌荷瘤小鼠奥沙利铂化疗模型,观察四君子汤对奥沙利铂毒性及NK细胞活性的影响,探讨四君子汤改善奥沙利铂对NK细胞抑制作用的机制,为经方用于结肠癌的治疗提供一定实验依据。方法:1.利用细胞毒性实验检测NK细胞的存活率,流式细胞实验检测NK细胞的表面受体NKG2D,PCR技术检测NK细胞TNF-α、IFN-γ、NKG2D的m RNA的表达,以观察不同浓度奥沙利铂对NK细胞的活性及功能的影响,探讨四君子汤能否能够降低药物毒性,并改善被奥沙利铂抑制的NK细胞活性。2.建立细胞共培养模型,利用荧光显微镜观察肿瘤细胞增殖情况,细胞毒性实验检测HCT116肿瘤细胞的存活率,ELISA实验检测NK细胞TNF-α和IFN-γ细胞因子的分泌程度,PCR技术检测肿瘤细胞中AKT1和PTEN m RNA的表达水平,以研究不同浓度四君子汤对奥沙利铂杀伤肿瘤细胞的影响,并探讨四君子汤与奥沙利铂联合使用后对肿瘤细胞以及NK细胞免疫功能的影响。3.建立结肠癌小鼠奥沙利铂化疗模型,利用活体成像技术观察各组小鼠皮下瘤的荧光强度,ELISA实验检测小鼠NK细胞TNF-α和IFN-γ细胞因子的分泌程度,PCR技术检测皮下瘤中AKT1及NKG2D m RNA的表达,免疫组化检测皮下瘤中AKT1及NKG2D抗体表达,WB实验检测皮下瘤中AKT1及NKG2D蛋白表达,以研究四君子汤对奥沙利铂化疗后结肠癌小鼠的肿瘤增殖及相关免疫通路蛋白的影响。结果:1.奥沙利铂(10μM)浓度下,NK细胞活性降低(P<0.01);奥沙利铂(25μM、50μM、100μM)浓度下,NK细胞活性同样降低,并整体呈递减趋势(P<0.001)。奥沙利铂(10μM、25μM、50μM)浓度下,NKG2D受体表达降低(P<0.01);奥沙利铂(100μM)浓度下,NKG2D受体表达降低(P<0.001)。2.联合用药的四君子汤(2.5mg/ml)浓度下,NK细胞活性提高(P<0.05),联合用药的四君子汤(5.0mg/ml)浓度下,NK细胞活性提高(P<0.01);在提前加入奥沙利铂(100μM)4H以后,四君子汤(2.5mg/ml)组,HCT116细胞存活率降低(P<0.05),四君子汤(5.0mg/ml)组,HCT116细胞存活率也显著降低((P<0.01)。3.奥沙利铂(100μM)组PTEN m RNA表达减低(P<0.01),与奥沙利铂组相比,联合用药组PTEN m RNA表达升高(P<0.001);奥沙利铂(100μM)组AKT1 m R NA表达降低(P<0.01),四君子汤(5.0mg/ml)AKT1 m RNA表达下降(P<0.05);与奥沙利铂组相比,联合用药组AKT1 m RNA表达显著下降(P<0.05)。4.小鼠活体成像显示,联合用药组比单一用药组的肿瘤荧光强度明显降低(P<0.05),并且联合用药组TNF-α分泌量相比奥沙利铂组明显升高,,而IFN-γ则明显降低(P<0.05);在m RNA的表达方面,奥沙利铂组的AKT1 m RNA的表达最高(P<0.01),而联合用药组与奥沙利铂组表达相反(P<0.001),值得一提的是,NK细胞的表面受体NKG2D m RNA,在奥沙利铂组的表达降低最为明显(P<0.05),联合用药组则显著升高(P<0.01),另外,在免疫组化抗体检测与WB蛋白检测方面,AKT1和NKG2D的表达情况基本与m RNA一致。结论:1.奥沙利铂可以降低人外周血NK细胞的活性,影响NK细胞活化受体NKG2D的比例。2.四君子汤可以降低奥沙利铂对NK细胞的毒性,提高NK细胞的活性。四君子汤可以增强奥沙利铂对HCT116细胞的杀伤。3.四君子汤和奥沙利铂联合使用,可以抑制结肠癌肿瘤的生长速度,可能与蛋白AKT1低表达有关。
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