【摘 要】
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目的:乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤,紫杉醇作为乳腺癌临床上常用化疗药物之一,在治疗乳腺癌方面具有良好的疗效,但长期使用容易产生耐药现象,严重制约了其临床应用。我们前期研究发现熊果酸能促进KLF4的表达水平,降低DNMT1的表达水平,且乳腺癌细胞对紫杉醇的敏感性与KLF4表达水平相关,本课题拟在前期基础上进一步探索熊果酸通过KLF4增强乳腺癌紫杉醇敏感性的机制,为熊果酸联合紫杉醇的临床应用提供理
【基金项目】
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国家自然科学基金（81703878）；
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目的:乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤,紫杉醇作为乳腺癌临床上常用化疗药物之一,在治疗乳腺癌方面具有良好的疗效,但长期使用容易产生耐药现象,严重制约了其临床应用。我们前期研究发现熊果酸能促进KLF4的表达水平,降低DNMT1的表达水平,且乳腺癌细胞对紫杉醇的敏感性与KLF4表达水平相关,本课题拟在前期基础上进一步探索熊果酸通过KLF4增强乳腺癌紫杉醇敏感性的机制,为熊果酸联合紫杉醇的临床应用提供理论依据。方法:1.采用免疫组化法和Western Blot检测乳腺癌组织与癌旁组织中KLF4、DNMT1的表达水平。Western Blot和细胞免疫荧光法检测不同乳腺癌细胞中KLF4表达水平。2.采用CCK-8法检测不同浓度PTX（5μM、10μM、20μM、40μM、80μM、160μM、320μM）对四种乳腺癌细胞的细胞增殖抑制的影响;通过慢病毒转染,构建过表达KLF4的MCF-7细胞株,q RT-PCR检测KLF4的m RNA表达水平,Western Blot检测KLF4的蛋白表达水平;CCK-8法检测KLF4基因改变后PTX对MCF-7细胞增殖抑制的作用和细胞生长的作用;流式细胞术法检测KLF4基因改变后PTX对MCF-7细胞凋亡的作用,分为空白对照组、PTX25μM作用组、PTX50μM作用组。3.采用质粒转染,构建干扰DNMT1的MCF-7和T47D细胞株,q RT-PCR检测DNMT1的m RNA表达水平,Western Blot检测DNMT1的蛋白表达水平;CCK-8法检测DNMT1基因改变后PTX对MCF-7和T47D细胞增殖抑制的影响,PTX分别用5μM、25μM、50μM、75μM。4.采用CCK-8法检测不同浓度的DIM和PTX分别作用MCF-7与T47D细胞的增殖抑制率;CCK-8法检测DIM联合PTX作用后的细胞增殖抑制率;流式细胞术检测DIM联合PTX作用后的细胞凋亡,分为空白对照组、DIM50μM作用组、PTX25μM作用组、PTX50μM作用组、DIM50μM联合PTX25μM作用组、DIM50μM联合PTX50μM作用组;q RT-PCR检测DIM作用于乳腺癌细胞后KLF4和DNMT1基因表达水平,Western Blot检测KLF4和DNMT1的蛋白表达水平。5.采用甲基化检测DIM作用于MCF-7后KLF4基因的甲基化水平改变。甲基化检测乳腺癌组织与癌旁组织中KLF4基因的甲基化水平改变。6.采用CCK-8法检测不同浓度的UA和PTX分别作用MCF-7细胞的增殖抑制率;CCK-8法检测UA联合PTX作用后的细胞增殖抑制率,分为UA20μM作用组、PTX25μM作用组、PTX50μM作用组、UA20μM联合PTX25μM作用组、UA20μM联合PTX50μM作用组。7.采用高通量m RNA测序检测熊果酸作用于乳腺癌细胞MCF-7后相关基因的表达水平改变。q RT-PCR检测熊果酸作用于乳腺癌细胞后KLF4的m RNA表达水平,Western Blot检测KLF4的蛋白表达水平。结果:1.乳腺癌组织中KLF4表达水平降低、DNMT1表达水平升高,KLF4基因启动子-148bp位点甲基化水平升高。2.过表达KLF4和干扰DNMT1后,促进PTX对MCF-7细胞增殖抑制作用。过表达KLF4后,促进PTX对MCF-7细胞凋亡作用,抑制MCF-7细胞生长。3.DIM能增强PTX对MCF-7和T47D细胞增殖抑制作用和促凋亡作用。DIM作用于MCF-7和T47D细胞后,KLF4表达水平上升、DNMT1表达水平下降。4.DIM作用于乳腺癌MCF-7细胞后,KLF4基因启动子-148bp位点甲基化水平下降。5.UA能够促进KLF4表达水平,降低DNMT1表达水平,增强乳腺癌细胞MCF-7对PTX敏感性。结论:1.乳腺癌组织中KLF4表达水平降低、KLF4基因启动子-148bp位点甲基化水平升高,KLF4表达增加能够促进乳腺癌细胞对紫杉醇的敏感性。2.乳腺癌组织中DNMT1与KLF4基因表达负相关,DNMT1抑制KLF4甲基化水平增强乳腺癌紫杉醇敏感性。3.UA抑制DNMT1促进KLF4表达增强乳腺癌细胞MCF-7对PTX敏感性。
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