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肝细胞癌(Hepatocllucler carcinoma,HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一,乙型肝炎病毒HBV持续性感染与HCC的发生发展密切相关。HBV病毒X基因(Hepatitis B virus X gene,HBX)编码的乙肝病毒x蛋白(Hepatitis B virus x protein,HBx)是病毒在感染细胞内复制,以及HBV病毒诱导HCC发生发展过程中的重要影响因子。近年来,微小RNA(micro RNA,mi RNA)在HBV诱导的HCC病理进程中的关键作用逐渐受到重视,但是,关于HBx蛋白影响肝细胞内mi RNA表达谱变化,以及系统的对这些mi RNA可能参与的HBV致病过程进行生物信息学分析尚未报道。本研究目的通过构建稳定表达HBV病毒X基因编码蛋白的人肝细胞系,研究HBV病毒X蛋白对肝细胞内mi RNA整体表达水平的影响,并对HBx诱导的mi RNA调控的生物学过程或细胞通路进行系统分析。第一部分HBX稳定表达细胞系的构建及验证目的:通过构建慢病毒载体Lenti-HBX,转染人正常肝细胞系L02和人肝癌细胞系Hep G2细胞,构建稳定表达HBx蛋白的L02-HBx和Hep G2-HBx细胞。方法:1.根据Gen Bank数据库中HBV病毒X基因序列设计克隆引物,进行HBX基因克隆,将扩增后的HBX基因序列通过TOPO克隆反应整合至p ENTR/D-TOPO质粒,通过LR重组反应构建慢病毒表达载体p Lenti6.3-HBX,然后与包装质粒体系共转染293T细胞进行慢病毒包装。2.将人正常肝细胞系L02和人肝癌细胞系Hep G2铺在24孔板中,待细胞完全贴壁并且生长至70%-80%孔底面积时进行慢病毒转染,转染24h后,筛选阳性转染细胞,并进行传代培养。3.利用实时定量PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)和免疫组化(IHC)两种方法鉴定转染HBX基因的人肝细胞系内HBx的表达。结果:1.成功构建了慢病毒表达质粒p Lenti6.3-HBX,质粒测序验证了p Lenti6.3-HBX质粒中的HBX基因序列与Gen Bank提供的序列完全一致。将p Lenti6.3-HBX质粒和空白质粒p Lenti6.3-Control分别与包装质粒共转染293T细胞进行慢病毒包装,分离纯化并测定了慢病毒Lenti-HBX和Lenti-Control的滴度。2.用包装了空白质粒的慢病毒载体Lenti-Control与慢病毒载体Lenti-HBX分别转染人正常肝细胞系L02和人肝癌细胞系Hep G2,使用1ug/ml杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选出阳性转染细胞L02-Control、L02-HBx、Hep G2-Control和Hep G2-HBx,进行传代培养。3.RT-PCR结果证明,相对于阴性对照细胞L02-Control和Hep G2-Control,转染Lenti-HBX的L02-HBx和Hep G2-HBx细胞内,HBx的m RNA水平显著升高6000倍左右,另外,细胞爬片免疫组化(IHC)结果同样证明了HBx蛋白在L02-HBx和Hep G2-HBx细胞内显著表达,而在阴性对照细胞L02-Control和Hep G2-Control内不表达。结论:成功构建了稳定表达HBx蛋白的L02-HBx和Hep G2-HBx细胞系,RT-PCR和细胞爬片免疫组化验证了细胞系内HBX基因的表达。第二部分生物信息学分析HBx蛋白诱导的异常表达的mi RNA目的:通过mi RNA芯片分析,筛选出由HBx蛋白诱导的表达变化差异明显的mi RNA,并对mi RNA及其靶基因参与的细胞生物学过程进行GO和KEGG pathway分析,预测这些mi RNA参与的可能与HBV诱导HCC发生相关的通路。方法:1.采用Trizol法抽提HBX稳定表达的人肝细胞系和转染空白质粒的阴性对照细胞系的总RNA,委托上海康成生物工程有限公司进行mi RNA芯片分析。2.利用mi Randa、Microcosom和Target Scan三种mi RNA靶基因预测程序,预测芯片分析结果中mi RNA的靶基因,并对mi RNA及其靶基因进行GO(Gene Ontology)分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)pathway分析。3.利用RT-PCR,在转染HBX基因的细胞系和感染HBV阳性的肝癌组织中,进一步鉴定芯片分析结果中mi RNA-211、mi RNA-219和mi RNA-663a的表达,以及上述三种mi RNA的靶基因长链乙酰辅酶A合成酶(Acyl-Co A Synthetase Long-chain family member 3,ACSL3)和YY1转录因子(Yin Yang 1 transciption factor,YY1的表达变化。结果:1.分别抽提L02-Control,L02-HBx,Hep G2-Control和Hep G2-HBx四种细胞系的总RNA,mi RNA芯片分析结果表明,在HBX高表达的L02-HBx和Hep G2-HBx两种细胞系中,共有19个mi RNA的表达水平发生了2倍以上显著变化。2.利用mi Randa、Microcosom和Target Scan三种程序对上述发现的19个mi RNA的靶基因进行预测,分别预测到38187、9684和5459个靶基因,其中有304个最有可能的靶基因在三种预测程序中都有预测到。通过Gene ontology(GO)分析和KEGG pathway分析,对mi RNA及其靶基因可能参与的生物学过程和功能进行深入探讨,发现mi RNA及其靶基因共同参与细胞的代谢、生物合成、信号转导调控等生理过程,并与多种人类癌症发生过程密切相关,而且,我们发现HBx诱导的mi RNA-211、mi RNA-219和mi RNA-663a参与乙型肝炎的发生过程。3.RT-PCR结果表明,在表达HBx蛋白的Hep G2-HBx细胞系和HCC癌组织中,mi RNA-211和mi RNA-219表达下降,mi RNA-663a表达上升,这与芯片结果一致,另外,mi RNA-663a的靶基因ACSL3表达下调,而mi RNA-211和mi RNA-219的靶基因YY1表达上升。结论:1.我们首次通过mi RNA芯片高通量分析,在mi RNA表达谱水平证实了HBx蛋白能够诱导人肝细胞内多种mi RNA的表达变化。2.通过GO分析、KEGG pathway生物信息学分析,我们发现HBx诱导的mi RNA主要参与细胞代谢、信号转导以及多种人类癌症的发生。在HBV感染引起的肝细胞癌中,HBx蛋白可能通过诱导肝细胞内多种mi RNA表达改变,共同作用于一种或几种细胞通路,促进HBV感染引起的HCC的发生发展。