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纳米抗体具备特异性强、亲和力高、稳定性好、免疫原性低和易于生产等特点,已被广泛应用于开发新的肿瘤免疫治疗策略和靶向药物。然而,纳米抗体不具有传统抗体的Fc结构,因此其不能通过直接激活抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC）和补体依赖的细胞毒作用（Complement-dependent cytotoxicity,CDC）等免疫功能发挥肿瘤的免疫治疗作用;此外,纳米抗体的分子量仅有传统抗体的十分之一,血清半衰期短,严重影响其药效的稳定发挥。为解决上述问题,本论文首先通过对一系列条件的优化实现了转肽酶Sortase A（Srt A,EC号:3.4.22.70）在大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）中的高效胞外分泌表达。随后利用Srt A介导的连接反应（Srt A-mediated ligation,SML）/融合表达手段构建了一系列具备抗体募集功能的纳米抗体,证实了基于抗体募集策略重构纳米抗体Fc端功能的可行性。主要结果如下:（1）实现Srt A在E.coli中的高效分泌表达。首先筛选出Pel B信号肽用来介导Srt A的胞外分泌表达,随后对Srt A基因上的稀有密码子进行优化,密码子优化后的重组菌在摇瓶发酵36 h后的胞外Srt A水平为11.7 U/m L。以密码子优化后的重组菌为出发菌株,一方面构建了5种共表达分子伴侣的重组菌,结果表明共表达分子伴侣Gro ES/Gro EL/Tig对Srt A分泌的增强作用最为明显,摇瓶发酵36 h可将胞外Srt A水平提升至34.0 U/m L;另一方面从不同添加剂中筛选出甘氨酸作为最适添加剂,并在随后对甘氨酸添加策略进行优化,发现利用两阶段甘氨酸添加策略（诱导后0和6 h在培养基中分别添加0.5%和1.0%的甘氨酸）对Srt A分泌的增强作用最为明显,7-L发酵罐发酵48 h后可将胞外Srt A水平提升至100.4 U/m L,为现有报道中的最高水平。（2）通过C端定点修饰半抗原2,4-二硝基苯（2,4-dinitrophenyl,DNP）重构纳米抗体Fc端功能。基于SML成功构建了四种含不同长度连接臂的7D12-DNP耦合物D1、D2、D3和D4。体外实验证明四种耦合物均可以特异性将抗DNP抗体募集到EGFR阳性的细胞上,并通过介导ADCC和CDC作用杀伤靶细胞。其中,连接臂为PEG3的耦合物D2具备最高的细胞毒性,A431细胞经100 n M D2处理后通过ADCC或CDC途径造成的裂解率分别为28.2%和31.1%。体内药代动力学实验证明在抗DNP抗体的存在下,四种耦合物的半衰期均能得到显著延长,其中耦合物D2在OVA-DNP预免疫小鼠中的半衰期达到了31.6 h,是相同条件下7D12的175.6倍。通过构建A431肿瘤异种移植小鼠模型对耦合物D2的体内抗肿瘤活性进行评估,结果显示治疗结束后D2组小鼠的肿瘤抑制率为65.9%,是7D12组的4.0倍。（3）通过修饰非特异性募集域或多募集域重构纳米抗体Fc端功能。利用融合表达手段成功构建了两种非特异性募集域纳米抗体7D12-ZZ和ZZ-7D12。试验表明这两种非特异性募集域纳米抗体均能特异性将Ig G抗体募集到EGFR阳性的细胞表面,并介导显著的细胞毒作用。药代动力学研究证明7D12-ZZ和ZZ-7D12的血清半衰期显著高于纳米抗体7D12,可分别达到25.9和29.5 h。通过构建三阴性乳腺癌（Triple-negative breast cancer,TNBC）异种移植小鼠模型评估7D12-ZZ和ZZ-7D12的体内抗肿瘤活性,结果证实7D12-ZZ和ZZ-7D12均能有效抑制TNBC的生长,治疗和观察阶段结束后7D12-ZZ和ZZ-7D12组小鼠的瘤重仅为7D12组的10.9%和5.3%。进一步地,利用SML在非特异性募集域纳米抗体C端耦合上半抗原DNP,构建了两种多募集域纳米抗体7ZD和Z7D,流式和体外毒性试验显示在抗DNP抗体的存在下,7ZD和Z7D可以比非特异性募集域纳米抗体在靶细胞表面募集更多的Ig G分子,并介导更强的细胞毒作用。（4）通过C端定点修饰半抗原鼠李糖（Rhamnose,Rha）重构双特异性纳米抗体（bispecific nanobodies,bs Nbs）Fc端功能。基于融合表达手段成功构建了7D12-C7b和C7b-7D12两种bs Nbs,流式试验显示7D12-C7b具备更高的亲和力。随后基于7D12-C7b利用SML构建了三种bs Nb-Rha耦合物R1、R2和R3。免疫荧光和流式试验表明三种耦合物均可以特异性靶向EGFR/HER2阳性的细胞并募集抗Rha抗体。进一步的体外毒性试验表明三种耦合物均可以通过介导ADCC/CDC作用杀伤靶细胞,其中连接臂为PEG3的耦合物R2具备最高的细胞毒性,A431细胞、SKBR3细胞和A431/HER2细胞经50 n M R2处理后通过ADCC途径造成的裂解率分别为26.5%、16.3%和26.4%,通过CDC途径造成的裂解率分别为30.1%、23.4%和33.4%。