角蛋白（Keratin）作为一种天然生物材料,具有良好的生物相容性与生物可降解性,在组织工程材料领域表现出广阔的应用前景。角蛋白酶（Keratinase）因具备独特的高效降解角蛋白纤维的特性,可有效提取毛发中的可溶性功能角蛋白,在角蛋白质资源的生物降解与角蛋白生物材料制备方面具有重要的研究价值与应用潜力。鉴于角蛋白酶的产量低和稳定性差是限制其工业化应用的主要原因,本研究以高效生产角蛋白酶及改善其热稳定性为目标,首先通过前导肽工程和启动子工程改造策略实现角蛋白酶的高效表达,进而应用计算机辅助设计与分子进化相结合的方法提高角蛋白酶的热稳定性;并以该角蛋白酶为催化剂,探索羊毛角蛋白的生物制备工艺,主要研究结果如下:（1）利用前导肽工程改造提高角蛋白酶的活性前导肽作为分子内伴侣,能够有效指导成熟酶的正确折叠以及活性构象的形成。本研究通过对重组Bacillus subtilis角蛋白酶Ker Bp的前导肽区域进行逐段截短,证明前导肽全长对成熟酶的表达具有至关重要的作用。通过对前导肽切割位点（P1）的氨基酸进行替换,发现芳香族疏水氨基酸苯丙氨酸有利于前导肽的切割,突变体Y（P1）F使角蛋白酶活性提升了1.7倍。另外,基于同源序列比对,对前导肽序列中非保守位点进行定点突变,获得6个酶活性显著提升的突变体,其中I（62）K突变体使角蛋白酶活性提高约2.2倍。进一步对上述6个位点构建饱和突变体文库,经过3轮有效筛选获得15个活性超过800 U·m L-1的突变体,其中突变体M7的酶活可达到1114 U·m L-1,较野生型提高6倍。（2）通过启动子元件改造调控宿主细胞生长与产酶过程研究发现随着活性和产量的提升,角蛋白酶对菌体内源性蛋白表现出降解能力,影响了B.subtilis宿主细胞正常的生长过程,导致菌体及产酶量的减少。本研究采用启动子元件改造调控宿主细胞生长与产酶过程,发现通过菌体密度依赖型启动子Papr E代替组成型启动子PHpa II,使产酶生物量获得提升,最高菌浓(OD600 nm)从8提高到10;酶活最高可达到2300 U·m L-1,是使用组成型启动子的2倍。通过对启动子的拷贝数进行优化,获得了重组菌角蛋白酶活性最高的二串联体启动子Papr E-Papr E,酶活可达3080U·m L-1。将启动子的-10区和-35区序列突变为σ因子识别的保守序列,进一步使酶活提高到3500 U·m L-1。另外,对培养基的碳源进行优化,促进了菌体的生长与积累,结果表明添加2%的葡萄糖能够延长菌体的生长时间,最大菌浓可达到15.6。同时产酶量也随着菌体生长时间的延长而增加,培养84 h后达到峰值4200 U·m L-1。（3）借助计算机辅助策略改造关键Loop区域提高角蛋白酶热稳定性角蛋白酶的热稳定性是其在高温下高效降解羊毛纤维等角蛋白质资源的先决条件,本研究基于计算机辅助设计与蛋白质工程改造相结合,提升角蛋白酶Ker Bp的热稳定性。通过计算机辅助计算与分析,预测了角蛋白酶Ker Bp的3段高柔性Loop以及一个与钙离子结合相关的Loop,并定位了其中对稳定性贡献较小的氨基酸残基。另外,基于同源序列比对分析,将Ker Bp序列中出现的“低频氨基酸”残基替换为同源序列中该位点的“高频氨基酸”。共构建了65个单点突变体,采取虚实结合的筛选策略,在保持酶活的基础上,获得了6个热稳定性提升的突变体,进一步通过组合突变构建获得6个位点的协同改造突变体,使角蛋白酶在60℃下的失活半衰期从17.3 min提高至66.1 min,并且最适反应温度从40℃提高至60℃。（4）利用角蛋白酶对羊毛纤维的可控降解制备大分子功能角蛋白角蛋白是性能卓越、极具应用潜力的生物材料,但由于天然的角蛋白结构紧密、可溶性差,难以直接作为生物材料进行应用。而采用化学法制备角蛋白通常会破坏分子上的活性基团,因此探索大分子、可溶性角蛋白的酶法制备具有重要意义。本研究利用自主开发的角蛋白酶水解废弃羊毛,制备出主要分子量约为45 k Da和28 k Da的可溶性角蛋白,其羊毛溶解率达68.1%,角蛋白提取率为33.7%。详细考察了羊毛的酶解过程,发现角蛋白酶能够从羊毛纤维的鳞片层进行逐层水解,最终实现羊毛复杂结构的破坏及溶解,通过对过程条件的控制,能够提取获得大片段可溶性羊毛角蛋白。体外评价结果显示,该角蛋白提取物具有良好的生物相容性,表现出明显的促细胞增殖和迁移的作用,并且具有较强的抗氧化性。为探索角蛋白提取物在生物组织材料领域的应用,研究利用角蛋白自组装特性制备获得水凝胶;小鼠成纤维细胞的体外培养实验结果表明该角蛋白凝胶具有良好的生物相容性,可作为细胞生长的支架材料。小鼠体内伤口促愈实验探究表明其能够通过促进成纤维细胞的增长和迁移以及加速形成新生血管和胶原沉积达到促进伤口修复的效果,证明该角蛋白水凝胶是一种优良的伤口敷料。