癌症已成为严重危害人类健康的疾病,是亟需解决的公共卫生问题。2018年中国肿瘤登记年报显示:我国新发癌症病例约占世界的1/4;其中胃癌新发病数第二,死亡数第三。因此,发展有效的防治肿瘤策略对于保障人民健康和促进社会经济发展具有重大的意义。多数癌症患者诊断时已经处于晚期,姑息性化疗是晚期肿瘤患者的主要治疗手段。当前以顺铂（cisplatin,DDP）为代表的铂类化合物仍应用于许多肿瘤的治疗,特别是一些实体瘤的治疗,如肺癌、胃癌等。顺铂主要通过诱导DNA双链损伤,促进细胞凋亡。虽然顺铂对机体有毒副作用,但由于其杀伤肿瘤的广泛性及有效性,仍应用于临床。肿瘤对顺铂的原发性耐受（intrinsicresistance）和获得性耐受（acquired resistance）严重影响了其疗效,限制了临床应用。顺铂耐药的肿瘤细胞也会对其他药物产生交叉耐药性。顺铂耐药的分子机制复杂多样:包括药物转运蛋白的活化;细胞内药物解毒作用增强;DNA修复能力增强;细胞凋亡抑制和细胞周期停滞等。铂类药物引起DNA损伤后,DNA修复通路活化是促进肿瘤细胞对铂类药物耐受的关键因素之一。因此,阐明肿瘤耐药细胞中异常表达或修饰的蛋白及其调节规律;针对耐药核心机制新发现的靶点开发抑制剂、激动剂或联合其它作用机制多靶点干预,是克服肿瘤耐药的当务之急。JWA又称ARL6IP5,其编码蛋白位于内质网,是微管结合蛋白。本课题组长期聚焦研究JWA基因的结构和功能。JWA是活跃的环境应答基因,修复氧化应激所致的DNA损伤。JWA近端启动子-76G/C多态性变异时,细胞便不能应答氧化应激,从而加重了环境毒物导致的DNA损伤和基因组不稳定,使人群中胃癌、食管癌等多种恶性肿瘤易感性显著增加。课题组前期发现胃癌组织中JWA的表达水平低于癌旁组织,与病人的预后呈显著负相关;JWA表达水平与铂类化疗方案所致总体生存率有关。肿瘤细胞内增加JWA表达可独立或与化疗药物协同抑制多种恶性表型。相对于亲本细胞,顺铂耐药的胃癌细胞中JWA表达水平均显著下降,而以XRCC1为代表的DNA双链损伤修复信号通路过度激活。在胃癌顺铂耐药细胞中,JWA通过抑制CK2介导的XRCC1 518S/519T/523T位点磷酸化,促进XRCC1泛素化降解,从而抑制了 XRCC1过度活化和超强的DNA修复能力,促进顺铂诱导的耐药细胞凋亡。顺铂耐药的肿瘤细胞除了 DNA修复信号网络异常,细胞凋亡信号通路发生紊乱,呈现此起彼伏的动态变化。我们前期研究发现获得性胃癌顺铂耐药细胞对肿瘤坏死因子诱导的凋亡相关配体（TNF-related apoptosis-induced ligand,TRAIL）敏感。TRAIL通过与其受体结合发挥诱导细胞凋亡的功能。尽管我们发现胃癌顺铂耐药细胞对TRAIL敏感,但其确切的分子机制还需要进一步深入研究。前期课题组研究发现JWA通过调节PARP1活性（PAR）从而保护氧化应激诱导的DNA单链损伤。当DNA损伤产生时,PARP1激活并招募其他DNA修复蛋白如XRCC1参与DNA修复。越来越多的研究报道PARP1抑制剂作为增敏剂提高多种肿瘤的化疗效果。但PARP1抑制剂是否可以促进顺铂诱导的胃癌耐药细胞凋亡还需要系统研究。基于课题组前期的研究基础,本研究拟从DNA损伤修复及死亡受体信号通路两个角度出发,探索胃癌顺铂耐药异常表达蛋白的调节规律;并针对新发现靶点实施干预,提出逆转胃癌顺铂耐药的新方法。目的:本研究基于DNA损伤修复通路和死亡受体信号通路在顺铂耐药中的作用,探讨以JWA为关键节点的分子网络调节胃癌细胞顺铂耐药的分子机制及干预研究。方法:1.用胃癌细胞皮下荷瘤模型观察肿瘤细胞内JWA敲低后对肿瘤生长及顺铂敏感性的影响;通过检测肿瘤体积及重量分析JWA靶向多肽单独及联合顺铂对胃癌生长的影响。2.通过蛋白免疫印迹、流式细胞分析、免疫荧光等技术探究JWA-MARCH8-DR4信号轴调节获得性胃癌顺铂耐药细胞对TRAIL敏感的作用。3.通过CCK8、蛋白免疫印迹、免疫荧光,平板克隆、Tunel,DNA损伤检测系统分析PARP1抑制剂在胃癌顺铂耐药细胞中的作用及分子机制。结果:1.HGC-27和NCI-N87细胞为原发性胃癌顺铂耐药细胞。CCK8结果显示顺铂作用于 HGC-27 和 NCI-N87 的 IC50 值分别是 5.163 μg/ml 和 10.809 μg/ml,而 BGC823 和 SGC7901 的 IC50 值分别是 0.811 μg/ml 和 0.408 μg/ml。Tunel染色法显示BGC823和SGC7901凋亡率分别为35.01 ±0.91%和43.89±1.26%,而HGC-27和NCI-N87在相同顺铂剂量下凋亡率分别为9.27±1.64%和4.57±1.07%,差异具有统计学意义（P<0.001）。2.JWA调节胃癌细胞顺铂敏感性。免疫印迹结果显示原发性及获得性胃癌顺铂耐药细胞JWA蛋白水平下降。荷瘤模型中,敲低胃癌细胞内JWA水平后,促进胃癌细胞生长和顺铂耐受,其中顺铂对si-con组肿瘤抑制率为55.8%（P<0.05）,si-JWA 组抑制率为 23.9%（P>0.05）。3.JWA靶向多肽单独及协同顺铂抑制胃癌生长。荷瘤模型结果显示顺铂组（抑制率56.9%,P<0.01）及JWA多肽组（抑制率39.4%,P<0.05）有效抑制胃癌生长,联合组抑瘤效果最显著（抑制率71.8%,P<0.001）。免疫印迹分析胃癌组织显示JWA靶向肽组及联合组相对于对照组,MMP2表达分别下降0.74和0.78倍,提示JWA靶向肽靶向抑制MMP2表达。免疫印迹检测胃癌组织显示JWA多肽组和顺铂治疗组γH2AX表达分别是对照组的2.17和2.28倍,联合组γH2AX表达是对照组的3.26倍;JWA多肽组及联合组XRCC1表达较对照组分别下降0.57和0.63倍,提示JWA靶向多肽抑制XRCC1表达,提高顺铂化疗敏感性。4.DR4上调促进获得性胃癌顺铂耐药细胞对TRAIL敏感。免疫印迹结果显示获得性胃癌顺铂耐药细胞BGC823/DDP和SGC7901/DDP较相应的敏感细胞DR4表达升高;流式细胞检测显示获得性胃癌顺铂耐药细胞膜上DR4含量显著高于对应敏感细胞,增高倍数分别为7.17±0.35和5.74±0.55。耐药细胞中,敲低DR4表达后TRAIL诱导的caspase3剪切体减少;而敲低DR5表达后TRAIL诱导的caspase3剪切体无明显变化。5.JWA通过溶酶体途径负调节DR4。免疫印迹结果显示在敏感细胞中转染si-JWA,DR4表达升高;耐药细胞中转染flag-JWA,DR4表达下降。流式检测结果显示在敏感细胞BGC823和SGC7901中转入si-JWA抑制JWA表达后,细胞膜表面DR4蛋白表达显著上调,分别升高3.69±0.48和2.66±0.06倍;耐药细胞BGC823/DDP和SGC7901/DDP中转入flag-JWA质粒回复JWA表达后,细胞膜表面DR4蛋白水平显著下降,分别降低0.46±0.05和0.59±0.04倍。免疫印迹结果显示溶酶体抑制剂阻断JWA高表达所致的DR4表达下降;免疫荧光结果显示JWA高表达后细胞膜上DR4表达减少,细胞质中表达增多并与溶酶体标志物LAMP2共定位。6.JWA活化MAPK信号通路,通过正调节MARCH8促进DR4泛素化降解。免疫印迹结果显示耐药细胞中过表达JWA后,促进flag-DR4（野生型）的泛素化降解,但不能促进flag-DR4（突变K273R）的降解。进一步利用免疫印迹技术分析显示JWA通过正调控MARCH8促进DR4泛素化降解。在耐药细胞中转染flag-JWA后,pERK活化,MARCH8表达上调,DR4表达下降,但MEK抑制剂处理后,pERK被阻断,JWA失去了对MARCH8和DR4的调控。7.JWA和DR4在胃癌组织中蛋白水平呈负相关。免疫印迹法结果显示21例胃癌组织中JWA和DR4蛋白表达呈现相反趋势,R2=0.3908,P<0.01,具有统计学意义。8.原发性胃癌顺铂耐药细胞对TRAIL耐受。CCK8结果显示HGC-27和NCI-N87两株细胞对TRAIL均不敏感（IC50分别为413和1632 ng/ml）。免疫印迹结果也显示相对于获得性耐药细胞,原发性耐药细胞中DR4表达水平明显低于获得性耐药。9.PARP1抑制剂促进顺铂诱导的耐药细胞凋亡。免疫印迹结果显示耐药细胞中PARP1活性（PAR）表达升高,JWA负调节PAR。免疫印迹结果显示耐药细胞中PARP1抑制剂AG14361单独使用有效抑制PAR,不促进耐药细胞凋亡;但明显促进顺铂诱导的Caspase3剪切体活化。Tunel染色法也显示顺铂组凋亡率为12.11±0.54%,联合组（BYK204165+顺铂或AG14361+顺铂）凋亡率分别为19.53±0.16%和14.43±0.46%,差异具有统计学意义。CCK8法结果显示HGC-27细胞中顺铂组细胞存活率为82.38±3.36%,联合组细胞存活率分别为为66.83±2.50%和71.09±1.83%;NCI-N87细胞中顺铂组细胞存活率为94.47±2.05%,联合组细胞存活率分别为为77.08±4.37%和71.72±0.89%,两种PARP1抑制剂在HGC-27和NCI-N87细胞中差异性均具有统计学意义。克隆形成实验结果显示两种PARP1抑制剂AG1461和BYK204165单独不能抑制耐药细胞增殖（P>0.05）;但显著提高顺铂化疗敏感性,HGC-27细胞中联合组较顺铂组克隆数分别减少21.67±0.48个和19.20±0.76个;NCI-N87细胞中联合组较顺铂组克隆数分别减少48.34±8.18个和51.33±1.70个;BGC823/DDP细胞中联合组较顺铂组克隆数分别减少121.22±10.61个和115.13±10.18个,差异均具有统计学意义（P<0.001）。10.PARP1抑制剂促进顺铂诱导的耐药细胞的DNA损伤和G0/G1阻滞。免疫荧光染色显示,HGC-27和NCI-N87细胞中,PARP1抑制剂AG14361联合顺铂显著增加了顺铂诱导的γH2AX阳性细胞数,分别增加30.40±8.12%和29.82±6.07%,差异均具有统计学意义（P<0.01）。免疫印迹结果显示HGC-27细胞中AG14361、BYK204165分别和顺铂联合处理后,与顺铂单独组相比,联合组中γH2AX水平提高,呈现时间效应和剂量效应。流式细胞检测结果显示单独AG14361处理HGC-27和NCI-N87细胞后,细胞周期未发生明显变化;但单独顺铂处理后,细胞G0/G1期阻滞;联合组（AG14361+顺铂）较顺铂单独组,G0/G1期阻滞进一步增加,其中HGC-27增加10.22±0.73%,NCI-N87增加 7.93±1.23%,差异均具有统计学意义。11.PARP1抑制剂阻断NHEJ通路。CCK8结果显示BGC823及HGC-27细胞对MX的的IC50分别为3.190和3.069 mg/ml,两者无统计学差异（P>0.05）。MX联合顺铂处理HGC-27细胞,CCK8结果显示MX不能减少细胞存活,差异无统计学意义（P>0.05）。免疫印迹结果也显示MX不能提高顺铂诱导的γH2AX的表达水平。CCK8结果显示BGC823和HGC-27细胞对姜黄素的IC50分别为18.212和9.794 μg/ml,差异具有统计学意义（P<0.001）。CCK8结果显示与顺铂组相比,姜黄素和顺铂联合使用后细胞存活率减少11.30±0.87%,差异具有统计学意义（P<0.05）。免疫印迹结果也显示姜黄素可以提高顺铂诱导的γH2AX的表达水平。HR及NHEJ检测报告系统分析显示PARP1抑制剂组GFP 阳性细胞数减少1.26±0.34%,差异具有统计学意义（P<0.001）,而不能有效抑制HR通路的GFP 阳性细胞数,无统计学差异（P>0.05）。12.PARP1抑制剂阻断DNA-PKcs和XRCC1的表达和活化。免疫印迹结果显示DNA-PKcs和XRCC1在原发性和获得性胃癌顺铂耐药细胞较敏感细胞表达一致性增高。DNA-PKcs抑制剂NU7441有效促进顺铂诱导的HGC-27细胞凋亡,与顺铂组相比,联合组细胞存活率下降8.35±1.16%,差异具有统计学意义（P<0.01）。免疫荧光、免疫印迹及免疫共沉淀技术发现PARP1抑制剂通过阻断DNA-PKcs和XRCC1的表达和活化,抑制它们的相互作用,进而抑制NHEJ修复通路,促进顺铂诱导的耐药细胞的DNA损伤和凋亡。结论:（1）首次在体内模型发现JWA低表达促进顺铂化疗耐受,JWA靶向多肽可以有效促进顺铂诱导的胃癌细胞凋亡。（2）获得性胃癌顺铂耐药细胞死亡受体信号通路活化,表现为获得性耐药细胞对TRAIL敏感,其分子机制是耐药细胞中JWA表达下降,抑制MEK-ERK信号通路活化,进而下调MARCH8,阻断了 DR4从细胞膜到溶酶体的泛素化降解。（3）耐药细胞中JWA负调节PAR,PARP1抑制剂通过阻断PAR活性,促进顺铂诱导的耐药细胞的DNA损伤和凋亡,其具体机制是PARP1抑制剂阻断NHEJ修复通路中的关键分子DNA-PKcs和XRCC1的表达和活化以及它们的相互作用。