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研究背景核苷(酸)类似物(nucleos(t)ide analogues, NA)的问世及其在临床中的应用,对于乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)慢性感染患者来说具有革命性的意义。可以短期内迅速抑制HBV复制,减轻肝脏炎症,延缓病情发展。由于HBV多聚酶(polymerase)缺乏严格的校正机制,在长期使用核苷(酸)类似物过程中耐药病毒株的出现似乎是不可避免的。耐药可以导致治疗失败和病情进展,是临床工作中一个棘手的问题。耐药突变株的选择是动态过程,从可检测到基因型耐药(genotypic resistance)到发生表型耐药(phenotypic resistance)(如病毒学突变及其后的生化学突变)的时间很大程度上依赖于突变病毒株的复制能力,因此对于耐药突变株的检测以及分析其复制能力可以帮助临床医生监测病毒耐药,根据患者不同的病毒学特征制定、优化抗病毒治疗,达到个体化治疗的目的。目的监测基因型耐药以辅助临床制定最合理的抗病毒治疗方案；分析新出现的突变对于HBV复制力的影响；为建立适用于临床的简便快速准确的表型分析提供方法学支持。方法首先对6000例慢性HBV感染患者进行耐药突变检测,对5例慢性乙型肝炎患者进行最短50周的随访,对1例患者进行了回顾性研究,监测HBV DNA和肝功能的动态变化；其次从6例慢性乙型肝炎患者血清中获得HBV全长基因组克隆11个,使用定点突变技术在特定位点引入突变得到19个克隆；接下来建立了高敏感性和特异性的实时PCR法,用于检测突变株的病毒复制力；最后使用无载体介导系统将30个克隆的HBV全长基因组转染入HepG2细胞系,使用实时PCR法评估病毒复制力,同时使用Southern免疫印迹法分析来源于#624患者的突变株的复制力以验证实时PCR的结果。结果(1)根据基因型耐药检测结果,临床医生及时调整抗病毒治疗方案,延迟或避免耐药的发生,提高了疗效；(2)我们建立的实时PCR具有高敏感性和可控制的变异性,最低检测下限为200 IU/mL,检测范围是6 Log1o单位；(3)相对于野生型HBV而言,rtL217P可以增加复制力1.98倍,rtM204I+rtL217P增加复制力1.20倍。其它突变不同程度地降低HBV的复制力。HBsAg的分泌水平的变化也基本一致。Southern免疫印迹法检测结果与实时PCR结果一致;(4)在受检6000例患者中,共有394例(6.57%)存在rt229突变,与LAM治疗相关的占78.93%,最常见的突变形式是rtL229V±LAM。复制力评价结果显示rt229位点的突变可降低HBV的复制力,部分恢复LAM耐药病毒株的复制力。结论(1)建议在基线及抗病毒过程中进行耐药突变监测,从而可以及早的对治疗进行干预,提高疗效；(2)rtL217P明显增强HBV的复制力,rt229突变明显抑制HBV的复制力,但二者均可以恢复LAM突变株的复制力,推测可能是LAM耐药的补偿突变;(3)本研究提供了可行的HBV复制力评价方法,有助于临床上评估从基因型耐药发展为表型耐药的时间以及表型分析在临床中的推广应用。