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目的:乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,其发病率已跃居女性恶性肿瘤的第一位。最新统计报告显示,全球乳腺癌的发病率和死亡率逐渐上升,年死亡人数大约40万人。因此,进一步研究乳腺癌的发生、发展机制具有重要意义。 表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)属于酪氨酸激酶受体(receptor tyrosine kinase,RTK)家族,包括erbB-1/EGFR、erbB-2/HER-2、erbB-3和erbB-4四个成员,其在细胞的增殖、分化、迁移和存活中发挥重要作用,它们的调控异常与肿瘤的发生、发展有密切的关系。已有报道,HER-2基因扩增和/或蛋白过度表达与乳腺癌的增殖和浸润密切相关,目前已经公认HER-2表达与否是判断乳腺癌预后的一个重要指标。HER-2形成二聚体后,分子中酪氨酸磷酸化可使受体活化,进而激活细胞内一系列信号转导通路,参与肿瘤细胞的增殖和分化等。目前针对HER-2的分子靶向药物已经用于临床治疗乳腺癌,但其单独应用有效率非常低,提示在HER-2过表达的乳腺癌中可能还有其它的分子在HER-2启动的致癌信号通路中发挥重要作用。因此,探索更为有效的乳腺癌治疗新靶点具有重要的意义。 有研究发现EGFR也是一种与乳腺癌预后不良相关的标志性分子。EGFR在大约35%~50%的乳腺癌组织中过表达,在三阴性乳腺癌(triplenegative breast cancers,TNBC)中的表达率约为60%。当EGF与EGFR结合后,通过受体二聚体化和相互磷酸化激活受体蛋白激酶,导致胞内酪氨酸激酶区域上的酪氨酸磷酸化,进而激活MEK/ERK及其下游信号传导通路,促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。通过阻断EGFR启动的信号通路将有助于抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移。 小凹蛋白-1(caveolin-1)是膜内陷囊泡(caveolae)的标志性结构蛋白,它广泛参与细胞的多种生命活动,主要通过磷酸化/去磷酸化途径与多种信号分子相互作用,调控细胞的转化、增殖、迁移和浸润等。已有研究证明,Caveolin-1可直接与EGFR结合并抑制其磷酸化。是否Caveolin-1能直接与HER-2结合并抑制其磷酸化?目前尚未见报道。 本研究拟在培养的乳腺癌细胞中,进一步探讨Caveolin-1调控EGFR、HER-2磷酸化(活化)及其下游信号通路对乳腺癌细胞增殖的影响。 方法: 1细胞培养 用含有10%胎牛血清(FBS)、青霉素100IU/ml、链霉素100IU/ml的1640培养基,在37℃、5%CO2恒温培养箱中培养乳腺癌MDA-MB-453、MDA-MB-436、SKBR-3细胞。 2明胶酶谱法检测不同乳腺癌细胞的侵袭能力 培养乳腺癌MDA-MB-453、MDA-MB-436、SKBR-3细胞,24小时内待细胞长满至培养皿的80%-90%,用无胎牛血清的1640培养基饥饿培养24小时,收集上清,应用明胶酶谱法测定不同乳腺癌细胞中MMP2、MMP9蛋白的活性,了解不同乳腺癌细胞的侵袭能力。 3细胞划痕修复实验检测不同乳腺癌细胞的迁移能力 培养乳腺癌MDA-MB-453、MDA-MB-436、SKBR-3细胞,待贴壁细胞密度为90%左右,饥饿培养细胞4小时,用无菌200ul移液器吸头在培养皿底部划一条直线,分别于6小时和12小时后观察划痕愈合宽度的变化,计算细胞迁移率。 4 Western Blot检测不同乳腺癌细胞Caveolin-1、EGFR、HER-2蛋白的表达 培养乳腺癌MDA-MB-453、MDA-MB-436、SKBR-3细胞,待细胞长满至培养皿的80%左右,用无胎牛血清的1640培养基饥饿培养4小时,收集细胞提取总蛋白,采用免疫印迹(Western Blot)法测定不同乳腺癌细胞中Caveolin-1、EGFR、HER-2蛋白的表达情况。 5激光共聚焦显微镜观察Caveolin-1和EGFR在乳腺癌细胞中的定位 培养乳腺癌MDA-MB-436细胞,用带有红色荧光羊抗鼠IgG和绿色荧光羊抗兔IgG的荧光二抗,进行免疫细胞荧光染色,激光共聚焦显微镜下观察Caveolin-1和EGFR蛋白在乳腺癌MDA-MB-436细胞中的定位。 6沉默或过表达Caveolin-1对乳腺癌细胞EGFR、HER-2、ERK磷酸化水平的影响 培养乳腺癌MDA-MB-453、SKBR-3、MDA-MB-436细胞,用Lipofectamine2000进行Caveolin-1pcDNA或Caveolin-1 siRNA质粒转染,观察Caveolin-1过表达或沉默Caveolin-1对乳腺癌细胞表皮生长因子受体磷酸化水平的影响。实验分组:乳腺癌MDA-MB-453、SKBR-3细胞分为Caveolin-1pcDNA转染组和pcDNA3.1转染组;乳腺癌MDA-MB-436细胞分为Caveolin-1siRNA转染组和阴性对照Shut1转染组。每组分别于EGF刺激0min、5min、10min、30min后收集细胞,提取蛋白,Western-blot检测各时间点Caveolin-1、HER-2、p-HER-2、EGFR、p-EGFR、ERK、p-ERK蛋白的表达。 7 MTT比色分析法检测Caveolin-1对乳腺癌细胞增殖的影响 培养乳腺癌MDA-MB-453、SKBR-3、MDA-MB-436细胞,用Lipofectamine2000进行Caveolin-1pcDNA或Caveolin-1 siRNA质粒转染,MTT法检测细胞增殖水平。实验分组:乳腺癌MDA-MB-453、SKBR-3细胞分为Caveolin-1pcDNA转染组和pcDNA3.1转染组;乳腺癌MDA-MB-436细胞分为Caveolin-1siRNA转染组和阴性对照Shut1转染组。每组分别于100nM的EGF刺激细胞24小时后,用MTT比色分析法检测乳腺癌细胞的增殖水平。 结果: 1不同乳腺癌细胞的侵袭能力比较 用Image J图像分析系统读取条带面积、宽度和灰度值进行结果分析,MMP9蛋白在乳腺癌MDA-MB-436(1.44±0.15)细胞中的活性明显高于MDA-MB-453(0.31±0.04)和SKBR-3(0.37±0.08)细胞,差异均有显著性(P<0.01)。MMP2蛋白在乳腺癌MDA-MB-436(1.65±0.37)细胞中的活性明显高于MDA-MB-453(0.40±0.11)和SKBR-3(0.38±0.09)细胞,差异均有显著性(P<0.01)。 2不同乳腺癌细胞的迁移能力比较 对不同乳腺癌细胞迁移距离的分析结果显示,乳腺癌MDA-MB-453细胞在划痕6小时(1.82±0.79%)和12小时(3.37±1.36%)与SKBR-3细胞6小时(2.41±0.92%)和12小时(4.52±0.89%)的迁移率比较均无明显差异,乳腺癌MDA-MB-436细胞在划痕6小时(18.71±4.06%)和12小时(36.80±3.42%)的迁移率均明显高于处于相应时间点的MDA-MB-453、SKBR-3细胞,差异均有显著性(P<0.01)。 3不同乳腺癌细胞Caveolin-1、EGFR、HER-2的蛋白表达 经Image J图像分析系统对蛋白条带进行灰度扫描分析,结果发现,Caveolin-1蛋白在乳腺癌MDA-MB-436(2.40±0.39)细胞中的表达明显高于MDA-MB-453(0.03±0.01)和SKBR-3(0.03±0.00)细胞,差异均有显著性(P<0.01)。HER-2蛋白在乳腺癌MDA-MB-453(1.05±0.13)、SKBR-3(2.12±0.32)细胞中的表达均明显高于MDA-MB-436(0.03±0.02)细胞,差异均有显著性(P<0.01)。EGFR蛋白在乳腺癌MDA-MB-436(0.75±0.07)、SKBR-3(0.97±0.10)细胞中的表达均明显高于MDA-MB-453(0.01±0.00)细胞,差异均有显著性(P<0.05)。 4 Caveolin-1和EGFR在乳腺癌细胞内的定位 激光共聚焦显微镜观察,在乳腺癌MDA-MB-436细胞中,Caveolin-1和EGFR蛋白共存于细胞膜上。 5沉默或过表达Caveolin-1对乳腺癌细胞EGFR、HER-2和ERK磷酸化水平的影响 5.1 Caveolin-1过表达对乳腺癌细胞EGFR、HER-2及ERK磷酸化水平的影响 用Image J图像分析系统对蛋白条带进行灰度扫描分析,结果显示,Caveolin-1pcDNA质粒转染乳腺癌MDA-MB-453细胞,20nM EGF持续刺激细胞0min、5min、10min、30min后,Caveolin-1pcDNA转染组Caveolin-1蛋白的表达(1.11±0.08、1.14±0.03、1.14±0.02、1.16±0.04)均明显高于相应时间点pcDNA3.1转染组(0.01±0.00、0.01±0.00、0.01±0.00、0.01±0.00),差异均有显著性(P<0.01)。20nM EGF持续刺激细胞5min、10min、30min后,Caveolin-1pcDNA转染组HER-2(0.48±0.05、0.57±0.09、0.40±0.02)、ERK(0.65±0.04、0.84±0.03、0.07±0.02)蛋白磷酸化水平均明显低于相应时间点pcDNA3.1转染组HER-2(0.76±0.03、0.87±0.06、0.65±0.12)、ERK(1.11±0.02、1.32±0.05、0.16±0.02)蛋白磷酸化水平,差异均有显著性(P<0.05)。 Caveolin-1pcDNA质粒转染乳腺癌SKBR-3细胞,20nM EGF持续刺激细胞0min、5min、10min、30min后,Caveolin-1pcDNA转染组Caveolin-1蛋白的表达(1.26±0.12、1.26±0.05、1.32±0.04、1.32±0.02)均明显高于相应时间点pcDNA3.1转染组(0.02±0.02、0.02±0.02、0.02±0.02、0.02±0.02),差异均有显著性(P<0.01)。20nM EGF持续刺激细胞5min、10min、30rain后,Caveolin-1pcDNA转染组HER.2(0.32±0.02、0.43±0.03、0.19±0.03)、EGFR(0.24±0.02、0.37±0.03、0.13±0.02)、ERK(0.06±0.02、0.40±0.16、0.36±0.04)蛋白磷酸化水平均明显低于相应时间点pcDNA3.1转染组HER-2(0.45±0.02、0.55±0.03、0.28±0.02)、EGFR(0.55±0.03、0.68±0.03、0.25±0.02)、ERK(0.40±0.02、0.93±0.09、0.45±0.03)蛋白磷酸化水平,差异均有显著性(P<0.05)。 5.2沉默Caveolin-1表达对乳腺癌细胞EGFR、ERK磷酸化水平的影响 用Image J图像分析系统对蛋白条带进行灰度扫描分析,结果显示,Caveolin-1siRNA质粒转染乳腺癌MDA-MB-436细胞,20nM EGF持续刺激细胞0min、5min、10min、30min后,Caveolin-1siRNA转染组Caveolin-1蛋白的表达(0.77±0.07、0.78±0.03、0.81±0.1、0.83±0.04)均明显低于相应时间点Shut1转染组(1.28±0.08、1.30±0.07、1.31±0.04、1.33±0.06),差异均有显著性(P<0.01)。20nM EGF持续刺激细胞5min、10min、30min后,Caveolin-1siRNA转染组EGFR(1.15±0.02、1.27±0.02、0.72±0.03)、ERK(0.71±0.02、0.85±0.02、0.61±0.03)蛋白磷酸化水平均明显高于相应时间点Shut1转染组EGFR(0.53±0.02、0.66±0.03、0.20±0.02)、ERK(0.41±0.02、0.50±0.03、0.31±0.01)蛋白磷酸化水平,差异均有显著性(P<0.01)。 6 Caveolin-1对乳腺癌细胞增殖的影响 在100nM浓度EGF刺激下,Caveolin-1pcDNA转染组MDA-MB-453(0.87±0.16)、SKBR-3(0.99±0.18)细胞的增殖水平均低于pcDNA3.1转染组MDA-MB-453(1.31±0.08)、SKBR-3(1.29±0.05)细胞,差异均有显著性(P<0.05);Caveolin-1 siRNA转染组MDA-MB-436(0.84±0.03)细胞的增殖水平明显高于阴性对照Shut1转染组(0.68±0.03),差异有显著性(P<0.01)。 结论: 1在乳腺癌细胞中,EGFR和HER-2蛋白表达水平不是决定配体诱导其活化、侵袭和迁移的唯一因素。 2 Caveolin-1通过影响乳腺癌细胞EGFR、HER-2蛋白磷酸化水平,调节二者所介导的Ras/Raf/MEK/ERK信号转导通路及其下游信号分子的激活,进而影响乳腺癌细胞的增殖。