microRNA-182及TGF-β2在骨肉瘤细胞中的表达及其对肿瘤细胞生物学行为调控作用的研究

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目的:本研究首先探索microRNA-182及TGF-β2在骨肉瘤细胞与正常成骨细胞及骨肉瘤组织与其周围正常组织中的表达是否存在差异;其次,干扰microRNA-182的表达,检测TGF-β2的表达变化,分析microRNA-182能否引起TGF-β2的表达变化;最后,在干扰microRNA-182表达的前提下,检测其是否能够引起骨肉瘤细胞生物学行为的变化。  方法:本研究以骨肉瘤MG-63细胞系和正常成骨细胞系hFOB1.19以及骨肉瘤组织及其周围正常组织作为研究对象。首先,通过实时荧光定量PCR检测两种细胞系及组织中microRNA-182的表达情况;免疫荧光技术(除外组织检测)及westernblot法检测两种细胞系及组织中TGF-β2的表达情况。其次,对MG-63细胞进行细胞转染并分别检测两种细胞系中microRNA-182及TGF-β2的表达变化,分析两者之间的可能调控关系。最后,对MG-63细胞进行细胞转染,通过不同的检测技术来观察骨肉瘤细胞的活性、增殖、凋亡、迁移及侵袭的变化。转染前分组为MG-63细胞组与hFOB1.19组及骨肉瘤组织组与正常组织组,所得数据采用t检验进行统计学分析;对于MG-63细胞转染后分组为inhibitor negative control组、mimicnegative control组、microRNA-182 inhibitor组、microRNA-182 mimic组,所得数据采用方差分析及Tukeys Multiple Comparison检验方法进行统计学分析。  结果:1、提取MG-63细胞与hFOB1.19细胞及骨肉瘤组织与其周围正常组织中的小RNA,使用qRT-PCR方法检测microRNA-182的表达水平。结果表明,microRNA-182在MG-63细胞及骨肉瘤组织中的表达量明显低于其在hFOB1.19细胞及正常组织中的表达量,差异均有统计学意义(P<0.05; P<0.01)。2、使用细胞的平均荧光强度值来评价TGF-β2的表达量,荧光图像结果显示,TGF-β2在MG-63细胞中的表达量与hFOB1.19细胞相比呈相对高表达状态。使用GAPDH作为内参,Western blot法检测两种细胞系及组织中TGF-β2的表达情况。实验结果表明,TGF-β2在MG-63细胞及骨肉瘤组织中的表达量与hFOB1.19细胞及正常组织相比呈相对高表达,差异均有统计学意义(P<0.01; P<0.01)。3、MG-63细胞转染后,提取细胞中的小RNA,使用qRT-PCR的方法检测不同细胞转染组中microRNA-182的表达情况。结果显示,microRNA-182 inhibitor组(0.63±0.12)与inhibitor negativecontrol组(1.87±0.08)比较其表达量明显降低;同时microRNA-182 mimic组(2.81±0.15)与mimic negative control组(1.89±0.11)相比其表达量明显升高,差异均有统计学意义(P<0.01)。4、MG-63细胞转染后,使用细胞的平均荧光强度值来评价TGF-β2的表达量。荧光图像显示,microRNA-182 inhibitor转染组中TGF-β2的表达水平高于inhibitor negative control组;microRNA-182 mimic转染组中TGF-β2的表达水平低于mimic negative control组。提取各组MG-63细胞的蛋白样本,使用GAPDH作为内参,western blot法检测TGF-β2的表达变化。实验结果显示,microRNA-182 inhibitor转染组中TGF-β2的表达量明显高于inhibitor negative control组;microRNA-182 mimic转染组中TGF-β2的表达量明显低于mimic negative control组,差异均有统计学意义(P<0.01)。5、MG-63细胞转染后,通过我们获得的OD值及标准曲线绘制了不同时间点的细胞增殖曲线,与细胞活性的变化相同,表达沉默microRNA-182可以促进肿瘤细胞的增殖;过表达microRNA-182可以抑制肿瘤细胞的增殖(P<0.05; P<0.01)。6、MG-63细胞转染后,通过流式分析结果可知,inhibitor negative control组、mimic negativecontrol组、microRNA-182 inhibitor组以及mimic组的细胞凋亡比例分别为7.32±0.27%、7.28±0.44%、4.62±0.48%以及14.76±0.72%; microRNA-182 mimic组的细胞凋亡比例高于对照组;microRNA-182 inhibitor组的细胞凋亡比例低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05;P<0.01)。7、MG-63细胞转染后,inhibitor negativecontrol组、mimic negative control组、microRNA-182 inhibitor组、mimic组的细胞迁移数量分别为87±10、91±7、165±9、55±8个(每个视野);inhibitornegative control组、mimic negative control组、microRNA-182 inhibitor组及mimic组的细胞侵袭数量分别为71±9、72±10、129±11、36±7个(每个视野);microRNA-182 inhibitor组的细胞迁移及侵袭数量明显升高(P<0.05; P<0.01),因此下调microRNA-182的表达可以促进MG-63细胞的迁移及侵袭。  结论:microRNA-182作为一种小分子调节RNA,在骨肉瘤中呈现低表达状态,对骨肉瘤的生物学行为具有调控作用。它在骨肉瘤中起到类似抑癌基因的作用,可以抑制骨肉瘤细胞的生长增殖、也可以抑制骨肉瘤细胞的迁移及侵袭;促进骨肉瘤细胞的凋亡;过表达microRNA-182可以发现TGF-β2表达量明显降低。microRNA-182可能为骨肉瘤基因治疗提供帮助。
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