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1.目的1.1结合临床观察,运用中医四诊合参及辨证论治,探索Wilson病伴骨代谢异常患者的中医证候分布特征;1.2运用补肾化痰祛瘀方的临床干预,了解中医药对Wilson病伴骨代谢异常患者的临床治疗效果;1.3通过动物实验观察TX小鼠模型股骨组织病理形态变化,并探知补肾化痰祛瘀方对TX小鼠骨代谢影响变化的作用机制,研究补肾化痰祛瘀方是否对TX小鼠骨组织发育具有一定的保护机制,以期为中医药干预治疗Wilson病合并骨代谢异常的患者提供可靠的实验理论依据。2.方法2.1证候调查对2019年1月~2019年12月就诊于在安徽中医药大学第一附属医院(安徽省中医院)的Wilson病确诊患者,按序完善其相关临床检查,依次进行筛查收录,纳入肝豆状核变性(WD)组138例,伴有骨代谢异常的肝豆状核变性(BD)组患者102例。对于符合入组标准的患者予以记录中医症状和体征信息,并统一收录入EXCEL表格汇总。2.2临床研究对2019年1月~2019年12月就诊于安徽中医药大学第一附属医院脑病科的60例合并有骨代谢异常的Wilson病患者,随机分类为治疗组及对照组,设置每组人数均为30。临床治疗方案:对照组予以常规保肝排铜等对症西药处理,治疗组患者通过临床辨证论治,除了予以常规西医治疗方案以外,加用补肾化痰祛瘀功效的经验中医方药。基于此治疗方案,对以上两组患者的中医证候进行积分统计,了解其积分变化情况及骨代谢异常症状的临床改善情况。2.3小鼠的基因型检测实验选取SPF级C3He-ATP7btx-j出生约7~10日的小鼠20只(雌雄各10只),用干净的手术剪、镊子及1.5ml EP管采集小鼠足趾样品(以利于动物编号)进行基因序列的提取,纯化以获取样本组织DNA,设计引物进行PCR反应扩增样品,经过凝胶切割切胶纯化后,通过Sanger测序进行验证。2.4实验研究在SPF级实验室环境下,适应性喂养50只C3He-ATP7btx-j小鼠14天,通过随机分组的方式,归类小鼠为空白组、Wilson病模型组、二巯丁二酸(DMSA)组、补肾化痰祛瘀方组、补肾化痰祛瘀方+DMSA组,共计5组,平均每组10只小鼠。实验过程中,小鼠每日给予的药物剂量按照体表面积来换算,与成人换算比值约为1:9。具体的小鼠灌胃方案为给药组每日20ml/kg的药物剂量,空白组及Wilson病模型组小鼠则予以同等体积的生理盐水,均于每日上午执行1次,连续14天。于灌胃周期结束后的首日,予以10%的水合氯醛对小鼠进行麻醉,实行颈椎脱臼以处死小鼠,取侧位,使用剪开皮肤,取其双侧股骨组织,剔除股骨表面软组织,置于装有4%中性甲醛溶液(4℃预冷)的EP管中固定48h以上,置于10%EDTA溶液内脱钙,每3天换一次脱钙液,利用大头针针扎测试骨组织软硬,以针扎可轻易通过时充分脱钙。在进行脱钙处理前,先将标本进行适宜的清水浸泡和流水洗涤,以降低甲醛的残留物质对后续制片效果的干预,后待制石蜡切片,备用HE染色法观察小鼠股骨组织病理形态结构的变化,并运用番红染色法进一步辨析小鼠软骨组织的剥脱与生长;通过免疫组化检测小鼠股骨组织中骨钙蛋白(Osteocalcin,BPG)与骨保护蛋白(Osteoprotegerin,OPG)的表达水平情况。3结果3.1纳入患者的中医证候要素分布率、证候积分、复合证型分布及危险系数调查3.1.1临床中医证候要素分布结果BD组患者的血瘀、痰湿、肾阴虚、肾阳虚证候要素分布率明显高于WD组(P<0.05);WD组患者肝阴虚、火热、脾阳虚、血虚证候要素分布率显著高于BD组(P<0.01或P<0.05);气郁、气虚证候要素的分布差异无统计学意义(P>0.05)。3.1.2纳入患者的临床中医证候积分对比情况对比WD组,BD组血瘀、痰湿、肾阴虚、肾阳虚患者的临床中医证候积分明显较高(P<0.01);而对比BD组,WD组火热、脾阳虚、肝阴虚的临床中医证候积分更高(P<0.01或P<0.05);气虚、气郁、阳亢、血虚的临床中医证候积分结果差异无统计学意义(P>0.05)。3.1.3纳入患者复合证型分布情况多个证候的分布上,BD组比例多于WD组(P<0.01);单个证候的分布上,WD组比例高于BD组(P<0.01);而在两个证候分布情况上看,WD组和BD组占比差异尚无统计学意义(P>0.05)。3.1.4临床中医证候对Wilson病伴骨代谢异常的危险系数相关研究利用Logistic回归分析法研究各中医证候对于WD伴有骨代谢异常患者的危险系数显示血瘀、痰湿、肾阴虚、肾阳虚的回归系数结果分别为2.609、3.242、2.801和3.121,并且均具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。3.2纳入患者的中医证候积分变化情况治疗前,经纳入的两组患者在临床中医证候积分结果上未体现明显差异性(P>0.05);而在治疗后,两组患者的临床中医证候积分结果可见显著下降,且治疗组患者的积分结果下降趋势更加显著,差异均有统计学意义(P<0.01)。3.3基因检测研究对SPF级C3He-ATP7btx-j出生约7~10日的小鼠运用Sanger测序法行基因型检测,结果显示:野生型小鼠为单峰测序峰图且未突变碱基G;杂合型小鼠为双峰测序峰图;纯合型小鼠突变碱基A测序峰图。3.4实验研究结果3.4.1补肾化痰祛瘀方对TX小鼠股骨组织病理形态改变的影响由HE染色观察TX小鼠股骨组织的病理结构可以看出:空白组小鼠股骨组织结构基本完整,排列整齐,骨小梁结构尚紧密,分布较均匀;而对比空白组,Wilson病模型组的小鼠股骨组织结构发生改变,排列紊乱,骨小梁明显稀疏松动,数量减少,断点较多,骨髓腔扩大,甚至出现无骨小梁的骨髓区。而DMSA组、补肾化痰祛瘀方组、DMSA+补肾化痰祛瘀方组的小鼠股骨组织病理紊乱变形程度低于Wilson病模型组,并且相比DMSA组及补肾化痰祛瘀方组小鼠的病理形态改变,DMSA+补肾化痰祛瘀方组明显较轻。经番红染色进一步清晰观察TX小鼠股骨组织中的软骨病理结构变化:空白组小鼠软骨组织表面光滑,宽度均匀,整个软骨层无裂缝、侵蚀,连接性完整,软骨细胞完整,边界清晰,细胞核正常,无萎缩,发育良好;而对比空白组,Wilson病模型组的小鼠软骨组织破坏断裂,厚度变薄,表层有侵蚀,不平整、粗糙,表层软骨有缺失,细胞排列紊乱,表现出明显的组织结构破坏征象。而DMSA组、补肾化痰祛瘀方组、DMSA+补肾化痰祛瘀方组的小鼠软骨组织发育良好,软骨面光滑、完整,并且DMSA+补肾化痰祛瘀方组TX小鼠的软骨形态更优于DMSA组及补肾化痰祛瘀方组。3.4.2补肾化痰祛瘀方对TX小鼠股骨组织中BPG蛋白及OPG蛋白表达及平均光密度水平的影响BPG蛋白结果:Wilson病模型组小鼠股骨组织中BPG蛋白的阳性表达及平均光密度水平与空白组相比显示明显下降(P<0.01);治疗组中DMSA组、补肾化痰祛瘀方组及DMSA+补肾化痰祛瘀方组的BPG蛋白的阳性表达及平均光密度水平相对Wilson病模型组提示显著增高(P<0.01);DMSA组与补肾化痰祛瘀方组与DMSA+补肾化痰祛瘀方组比较,其BPG蛋白阳性表达及平均光密度水平有所降低(P<0.05)。OPG蛋白结果:Wilson病模型组小鼠股骨组织中OPG蛋白的阳性表达及平均光密度水平与空白组相比显示明显下降(P<0.01);治疗组中DMSA组、补肾化痰祛瘀方组及DMSA+补肾化痰祛瘀方组的OPG蛋白的阳性表达及平均光密度水平相对Wilson病模型组提示显著增高(P<0.01);DMSA组与补肾化痰祛瘀方组与DMSA+补肾化痰祛瘀方组比较,其OPG蛋白阳性表达及平均光密度水平有所降低(P<0.05)。4.结论4.1 Wilson病骨代谢异常发生的主要临床中医证候要素是血瘀、痰湿、肾阴虚、肾阳虚;4.2 Wilson病骨代谢异常发生的主要危险中医证候要素是血瘀、痰湿、肾阴虚、肾阳虚;4.3 Wilson病伴随骨损伤的逐渐加重,肝豆状核变性合并骨代谢异常的证候愈加复杂;4.4补肾化痰祛瘀方可有效改善Wilson病伴骨代谢异常患者的中医证候积分,缓解其临床症状严重程度;4.5小鼠基因检测上,野生型小鼠单峰图碱基G未突变,而杂合型小鼠及纯和型小鼠双峰图碱基G突变为碱基A;4.6 TX小鼠存在一定程度的股骨组织结构形态损伤,骨细胞发育障碍,影响了骨代谢的平衡;4.7补肾化痰祛瘀方可在一定程度上提升TX小鼠骨组织中BPG蛋白及OPG蛋白表达水平,改善TX小鼠的骨代谢障碍情况。