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研究背景:原发性肺癌是目前全球癌症相关死亡的主要原因,非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)约占85%,并且80%左右的NSCLC患者在确诊时已属局部晚期或伴远处转移(IIIB期-IV期)。根治性同步放化疗作为不可切除局部晚期NSCLC的标准治疗,仅获得61%的局部缓解率,5年生存率仅15%～20%;然而,放射性肺炎(radiation pneumonitis,RP)作为肺部肿瘤放疗常见的严重并发症和剂量限制毒性,发生率达5-15%,会导致治疗中断甚至死亡等严重的临床后果,目前尚缺乏有效的治疗手段;脑转移被认为NSCLC的严重不良预后因素,一旦发生,患者自然生存仅2-4个月,预后更差。因此,如何准确地判断纵隔淋巴结有无转移,精准地勾画纵隔淋巴结照射野,预防放射性肺炎发生;如何确实地提高脑转移病灶的控制率,将为改善晚期NSCLC患者的生存期,实现个体化、精准化治疗提供理论依据。研究方法:1、收集陆军军医大学大坪医院经病理及基因检测证实EGFR敏感突变的NSCLC临床标本,其中有/无纵隔淋巴结转移(mediastinal lymph node,MLN)的共10例,利用转录组测序、生物信息分析等方法筛选出肺癌MLN转移的关联基因;2、利用慢病毒建立BCDIN3D的干扰PC9细胞系,采用克隆形成、划痕实验、transwell等方法进行功能验证;3、应用实时定量PCR、免疫组化等检测手段,检测EGFR敏感突变的NSCLC患者肺原发病灶及纵隔转移病灶中BCDIN3D的差异性表达;4、进一步利用转录组测序结果进行生物信息学分析,明确不同EGFR突变类型的NSCLC纵隔淋巴结转移的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),并应用q RT-PCR的方法对差异基因进行验证。5、收集陆军军医大学大坪医院11例非小细胞肺癌肺原发灶及脑转移灶患者组织切片以及手术前静脉血常规结果,免疫组化法检测肺原发灶及脑转移灶PD-L1表达水平,计算血常规中的中性粒细胞与淋巴细胞比值(neutrophil-to-lymphocyte ratio,NLR),并绘制患者ROC曲线,分析其与患者ORR、DCR、DFS及OS的相关性。研究结果:1、转录组测序分别检测出有纵隔淋巴结转移和无纵隔淋巴结转移EGFR敏感突变NSCLC在转录水平的基因表达情况。使用Cuffdiff软件共筛选获得169个DEGs,在有纵隔淋巴结转移样本中有68个DEGs表达上调;101个DEGs表达下调。2、应用EGFR敏感突变的PC-9细胞对68个上调的DEGs进行q RT-PCR表达量验证,其中49个基因明确上调,基于此构建候选基因文库,为下一步构建慢病毒RNAi干扰实验筛选靶基因进行准备。3、针对候选基因设计合成干扰靶点,并构建相应的病毒骨架质粒。发现感染条件为:MOI=1(细胞感染已经达到60%以上),即滴度为1×10~8 TU/m L的病毒,加入0.1μl病毒液;培养基加入Eni.S+Polybrene,目的细胞易感染,可进入慢病毒感染后的下游实验。4、sh RNA-BCDIN3D慢病毒感染3天后,实验组PC-9细胞中BCDIN3D基因在m RNA水平的表达受到干扰。5、经sh RNA慢病毒感染3天后,细胞划痕24小时经Cellomics检测,发现实验组PC-9细胞的迁移能力受到显著抑制,提示BCDIN3D基因能够促进PC-9细胞迁移。6、sh RNA-BCDIN3D慢病毒感染PC-9细胞3天后,实验组PC-9细胞的转移能力受到显著抑制。提示BCDIN3D基因与PC-9细胞的转移能力显著相关。7、sh RNA慢病毒感染3天后,实验组PC-9细胞的侵袭能力受到显著抑制。8、sh RNA慢病毒感染5天后WB检测发现,实验组PC-9细胞部分EMT过程受到抑制。9、我院54例行手术治疗的肺腺癌患者,肺原发病灶及纵隔转移病灶q RT-PCR检测BCDIN3D m RNA的表达,在m RNA水平,BCDIN3D是纵隔淋巴结转移的独立预测因素。10、我院54例及外院78例肺腺癌患者肺原发病灶及纵隔转移病灶免疫组化检测BCDIN3D蛋白的表达,在蛋白水平,BCDIN3D是男性及EGFR19Del患者纵隔淋巴结转移的独立预测因素。11、通过Illumina平台,使用Pair-end 100的方式对10例EGFR敏感突变NSCLC患者的组织样本进行高通量转录组测序,发现下调表达基因100个,上调表达基因69个;12、进一步表达模式聚类分析提示,EEF1A2在EGFR19Del患者中显著下调,而在L858R患者中则表达上调;ERN2在EGFR19Del患者中显著上调,而在L858R患者中下调表达。13、肺原发灶中4例PD-L1高表达,脑转移灶中3例高表达;高于脑部NLR截断值3.0553者为5例。14、单因素及多因素分析结果均显示:脑转移灶PD-L1的染色强度是OS的独立预后因素(p=0.012),PD-L1与NLR两者联合评估与OS具有显著相关性(p=0.034)。研究结论:1、BCDIN3D基因表达与EGFR敏感突变NSCLC淋巴结转移密切相关,可能成为预测NSCLC纵隔淋巴结分期的重要生物学标记,为实现精准勾画肺癌纵隔淋巴结靶区,缩小胸部照射野,降低放射性肺炎发生提供指导依据。2、EGFR19Del和L858R两种不同的突变类型肺腺癌患者在发生纵隔淋巴结转移过程中,多个基因的表达模式及相关分子机制存在明显差异。从淋巴结转移的角度,进一步丰富了EGFR19Del和L858R是两种独立疾病的理论。3、肺原发灶及脑转移灶的PD-L1高表达和术前高NLR值与治疗反应差及预后不良相关。NLR可能是PD-L1抗体疗效的预测因子。