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血管NADPH氧化酶（NADPH-oxidase）激活引起的活性氧（Reactive oxygen species,ROS）增多在心肌肥厚的发病过程中发挥着关键的作用,其催化亚基NOX包括多个亚型,但是在心肌肥厚发病中何种NOX亚型是有害的因素,何种NOX亚型是保护的因素尚不明确,NOX调控的下游信号通路还有待进一步研究。前期研究发现肾性高血压大鼠心脏中NOX4的表达随着心肌肥厚程度增加呈上升趋势,并且随着心肌肥厚的发展组蛋白脱乙酰化酶（Histone deacetylase,HDAC）的表达也发生了变化,提示NOX4与HDAC均参与了高血压左心室肥厚的发病过程。研究NOX4在心肌肥厚中的调节模式,进一步揭示NOX4对心肌肥大信号的融合节点HDAC4和心肌肥大负性调控因子糖原合成酶激酶-3β（Glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β）的调控机制,对研发心血管疾病的新靶点药物具有重要价值,为临床高血压和心力衰竭的治疗提供潜在的治疗思路。目的:研究心肌肥大时NOX4的功能和调控机制,特别是其对HDAC4的调控和Akt/GSK-3β信号通路的影响,为明确NOX4在心肌肥大发病中的调节机制提供理论依据。方法:1.SD大鼠乳鼠心肌细胞分离培养并建立心肌肥大模型:采用胰蛋白酶消化和差速贴壁法分离培养新生2-3天乳鼠的原代心肌细胞,采用内皮素-1（Endothelin-1,ET-1）诱导建立心肌肥大模型。2.ET-1药物浓度的确定:通过检测心肌细胞表面积的变化,采用实时荧光定量聚合酶链式反应（Quantitative-polymerase chain reaction,QT-PCR）法检测心肌细胞内胚型基因心房利钠因子（Atrial natriuretic factor,ANF）和β-肌球蛋白重链（Beta-Myosin heavy chain,β-MHC）m RNA表达,探索诱导心肌肥大的ET-1的剂量。3.实验分组:应用NOX4抑制剂GKT137831抑制心肌细胞的NOX4基因,分为空白对照组（control）、GKT137831组、ET-1组、GKT137831+ET-1组。测量心肌细胞表面积;QT-PCR法检测心肌细胞内胚型基因ANF和β-MHC m RNA的表达。4.肥大模型中ROS生成、NADPH氧化酶表达的变化:DHE染色检测心肌细胞中ROS产生;Western blot方法检测NADPH氧化酶催化亚基NOX4和调节亚基p47phox的蛋白表达。5.心肌肥大信号通路蛋白的检测:采用Western blot检测信号分子phospho-473Akt、Akt、phospho-GSK-3β、GSK-3β、phospho-HDAC4、HDAC4和转录因子NFATc4的蛋白表达;免疫荧光检测转录因子NFATc4的亚细胞定位。6.三条针对NOX4的siRNA（si-NOX4-1,si-NOX4-2,si-NOX4-3）转染心肌细胞。转染24 h后,QT-PCR和Western blot法检测心肌细胞内各组NOX4表达水平,筛选有效干扰序列。7.采用siRNA沉默心肌细胞NOX4基因表达。分为空白对照组、阴性对照组（Negative Control,NC）、ET-1组、si-NOX4-3组、NC+ET-1组、si-NOX4-3+ET-1组。8.有效干扰序列si-NOX4-3沉默心肌细胞NOX4基因表达后,同以上4和5的方法检测心肌肥大、ROS生成、NADPH氧化酶表达、肥大信号分子Akt/GSK-3β和转录因子HDAC4、NFATc4的表达变化。结果:1.ET-1可以诱导心肌肥大,NOX4抑制剂GKT137831显著抑制了ET-1诱导的心肌肥大,降低了心肌细胞表面积和胚型基因ANF和β-MHC m RNA水平。2.GKT137831降低了ET-1诱导心肌肥大中ROS的生成,抑制了NADPH氧化酶催化亚基NOX4和调节亚基p47phox的蛋白表达。3.GKT137831抑制了ET-1诱导心肌肥大中Akt和GSK-3β磷酸化水平,抑制了核转录因子NFATc4的表达。4.GKT137831抑制了ET-1诱导心肌肥大中HDAC4的磷酸化表达。5.三条siRNA都显著的抑制心肌细胞NOX4的mRNA和蛋白表达,其中si-NOX4-3的抑制作用最明显。6.si-NOX4-3沉默心肌细胞NOX4基因表达后,抑制了ET-1诱导的心肌细胞表面积增加,降低ROS的生成,下调了NOX4和p47phox的蛋白表达,同时也抑制了Akt/GSK-3β信号通路的激活,以及转录因子HDAC4和NFATc4的表达。结论:1.GKT137831和siRNA沉默NOX4基因显著抑制了ET-1诱导的心肌肥大,该作用与其抑制NOX4的表达,进而抑制ROS生成有关。2.NOX4在ET-1诱导心肌肥大中发挥着重要中作用,抑制和沉默NOX4的表达可以显著抑制肥大信号通路Akt/GSK-3β的激活和NFATc4的表达,抑制转录因子HDAC4蛋白的磷酸化表达。