【摘 要】
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南极磷虾（Euphausiidae）是一类广泛分布于南极海域的多年生浮游甲壳动物。从南极磷虾中得到的活性肽已被证实具有抗氧化、降压、抗菌等活性。本课题选取已知肽序列的南极磷虾活性肽作为实验材料,其氨基酸序列为Val-Asp-Lys（F1）,Val-Glu-Ala-Asp（F2）,Val-Ala-Lys-Arg-Ser（F3）,Val-Gly-Lys（F4）,Val-Gly-Lys-Trp（F5）,
【基金项目】
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国家项目（项目编号:GN18D060003）；
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南极磷虾（Euphausiidae）是一类广泛分布于南极海域的多年生浮游甲壳动物。从南极磷虾中得到的活性肽已被证实具有抗氧化、降压、抗菌等活性。本课题选取已知肽序列的南极磷虾活性肽作为实验材料,其氨基酸序列为Val-Asp-Lys（F1）,Val-Glu-Ala-Asp（F2）,Val-Ala-Lys-Arg-Ser（F3）,Val-Gly-Lys（F4）,Val-Gly-Lys-Trp（F5）,Ile-Asn-Lys（F6）,Ala-Ser-Gln（F7）,Ile-Asn-Lys-Trp-Trp（F8）,Ile-Met-Pro（F9）,Ile-Met-Pro-Lys-Asn（F10）,Phe-Leu-Ala（F11）,Lys-Ile-Thr（F12）,Val-Glu（F13）,Val-Glu-Val-Val（F14）,Val-Lys（F15）,Val-Lys-Met（F16）,Val-Thr（F17）,Ile-Ser（F18）,Ile-Ser-Phe（F19）,Leu-Thr（F20）,Leu-Thr-Val-Ile-Met（F21）,Leu-Glu-Phe-Val-Phe（F23）。采用油酸（OA）诱导人肝癌细胞（Hep G2）建立体外非酒精性脂肪性肝病模型,评价南极磷虾寡肽对体外NAFLD的保护作用,并对其作用机制进行研究。主要研究内容与结果如下:（1）建立体外非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）细胞模型:采用OA诱导Hep G2细胞建立NAFLD体外模型。MTT实验结果表明0.4 m M以上浓度的OA对细胞活性有明显影响,细胞存活率降至90%以下;油红O染色实验观察到OA能够诱导细胞内脂质堆积,0.4 m M及以上浓度的OA能够使细胞内的红色脂滴数量显著增加;TG含量测定结果表明细胞内的TG含量随着OA浓度的升高而显著增加。当OA浓度为0.4 m M时,对细胞活性无明显抑制作用,细胞内存在大量红色脂滴,且细胞内TG含量明显升高,体外NAFLD细胞模型建立成功。（2）南极磷虾寡肽对体外NAFLD保护作用的活性评价:通过MTT实验得知300μM寡肽处理Hep G2细胞48 h,对细胞活性无明显影响。利用建立好的NAFLD细胞模型来筛选具有保护作用的寡肽,其中F13、F15、F19和F20能够极显著降低细胞内TG含量（p＜0.001）。之后对筛选出来的南极磷虾寡肽进行降脂活性评价,通过油红O染色实验观察到F13、F15、F19和F20均能显著减轻Hep G2细胞内脂质沉积;且四条寡肽在100-300μM浓度下减少了细胞内TG、TC的含量,并呈现浓度依赖性。对南极磷虾寡肽进行抗氧化活性评价,结果表明F13、F15、F19和F20能够抑制OA所引起的ROS生成增加;显著提高下游蛋白酶:CAT、SOD和GSH-Px活力;降低脂质过氧化产物MDA含量。最后对南极磷虾寡肽的抗炎活性进行评价,结果显示F13、F15、F19和F20均能显著性的降低细胞内炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。综上所述,南极磷虾寡肽通过降脂、抗氧化、抗炎等三个方面来对体外NAFLD模型进行保护。（3）南极磷虾寡肽对体外NAFLD保护作用的机制研究:Western blot实验结果表明F13、F15、F19和F20均能减少调脂蛋白SREBP-1c的表达,减轻细胞内脂质堆积;F13、F15、F19和F20还可调控抗氧化通路Nrf2/HO-1,使其蛋白表达增加,缓解细胞内氧化应激反应;之后研究南极磷虾寡肽对上游蛋白AMPK的调控,并通过AMPK抑制剂Compound C验证AMPK是否调控氧化应激和炎症反应。结果表明,F13、F15、F19和F20均能浓度依赖性的增加AMPK磷酸化水平;而AMPK抑制剂Compound C逆转了寡肽对抗氧化通路Nrf2/HO-1的调控作用和对细胞内炎症反应的抑制作用。综上所述,南极磷虾寡肽不仅通过激活AMPK磷酸化抑制SREBP-1c的表达,从而减少细胞内脂质合成;还通过激活AMPK/Nrf2信号通路来上调HO-1的表达,从而缓解NAFLD中的氧化应激和炎症反应。综上,南极磷虾寡肽具有降脂、抗氧化和抗炎的作用,可用于保肝护肝药物候选成分的开发,有望用于非酒精性脂肪性肝病的预防和治疗。本课题研究为南极磷虾活性物质的开发提供数据支持,为食源性肽相关保健品的研发提供理论依据。
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