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肺癌是世界上最常见的肿瘤之一,并且其发病率还在继续上升。目前关于肺癌发生与发展的分子机制仍不清楚。 本研究用Northern blot方法比较了Smad7基因在永生化人支气管上皮细胞BEP2D和α粒子辐射诱发恶性转化的细胞BERP35T2中的表达差异以及细胞对TGF-β1细胞因子刺激的反应性。用Smad7基因真核表达载体转染BEP2D及BERP35T2细胞,筛选稳定转染的阳性细胞克隆,以外源性TGF-β1作为刺激因子,观察Smad7对细胞生长、增殖的影响。用体外转录的方法制备了分别以Smad7基因编码区中542bp～563bp及701bp～722bp两段序列为靶序列的siRNAs,即542siRNA和701siRNA。用Smad7表达质粒及542siRNA、701siRNA瞬时转染恶性化的BERP35T2细胞,随后用Northern blot方法检测细胞中Smad7 mRNA表达水平的变化。用siRNA瞬时转染BERP35T2细胞,并添加外源性TGF-β1作用于细胞,观察其对细胞生长、增殖的影响。其结果如下: 1.Smad7在永生化及辐射诱发恶性转化细胞模型中的异常表达及对TGF-β1刺激的应答:Northern blot结果显示,辐射诱发恶性转化的BERP35T2细胞Smad7 mRNA表达水平明显高于永生化BEP2D细胞;外源性TGF-β1可迅速诱导永生化BEP2D细胞中Smad7 mRNA表达,但对恶性化BERP35T2细胞作用不明显。 2.Smad7对细胞增殖及TGF-β介导的细胞生长抑制效应的影响:同BEP2D细胞相比,Smad7表达高的BERP35T2细胞增殖能力强,TGF-β1对该细胞生长、增殖的抑制能力减弱。BERP35T2及BEP2D细胞稳定转染Smad7基因后两细胞系增殖能力均显著增强,TGF-β1对转染Smad7基因后细胞的生长抑制作用均显著减弱。 3.利用RNA干涉技术对Smad7基因表达的阻断及其对BERP35T2细胞增殖和TGF-β介导的生长抑制效应的影响:在无siRNA干扰的情况下,BERP35T2细胞中内源性Smad7 mRNA高表达,同时外源性Srnad7 mRNA也呈高表达。而在加入siRNA后,内源性Smad7 mRNA几乎完全降解,且外源性Smad7 mRNA的表达也在很大程度上受到了抑制。542siRNA与701siRNA对靶mRNA的降解作用没有显著差别。无论是siRNA还是TGF-β1均可抑制BERP35T2细胞的增殖,而二者共同作用于细胞时,细胞表现出更为强烈的生长抑制作用。 通过本研究可以得出以下认识:在α粒子辐射诱发人支气管上皮细胞发生恶性转化过程中,Smad7基因表达增高,过表达的Smad7通过负调控TGF-β信号转导通路来降低TGF-β1对细胞的生长抑制作用,从而促进细胞的生长、增殖能力,使细胞进一步向恶性化方向发展。利用RNAi技术能有效抑制Smad7基因在恶性化的人支气管上皮细胞中的表达,Smad7基因的低表达也可反馈调节TGF-β信号转导通路,使细胞对TGF-β1刺激应答的敏感性增加,增强了TGF-β1介导的生长抑制作用,导致细胞的生长增殖能