【摘 要】
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世界范围内,每年因呼吸道感染性疾病而死亡的儿童人数高达200万;在我国,呼吸道感染性疾病是造成5岁以下儿童死亡的首要原因。病毒、细菌、真菌、支原体及衣原体均可引起儿童呼吸道感染,引发普通感冒、支气管炎、肺炎等常见临床症状。儿童呼吸道感染,早期快速准确地诊断有助于临床精准治疗,帮助患儿恢复健康。基于此,本论文建立了可覆盖36种儿童呼吸道感染性疾病病原体的多重荧光定量PCR检测方法,并调查了云南省儿童
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世界范围内,每年因呼吸道感染性疾病而死亡的儿童人数高达200万;在我国,呼吸道感染性疾病是造成5岁以下儿童死亡的首要原因。病毒、细菌、真菌、支原体及衣原体均可引起儿童呼吸道感染,引发普通感冒、支气管炎、肺炎等常见临床症状。儿童呼吸道感染,早期快速准确地诊断有助于临床精准治疗,帮助患儿恢复健康。基于此,本论文建立了可覆盖36种儿童呼吸道感染性疾病病原体的多重荧光定量PCR检测方法,并调查了云南省儿童呼吸道感染性疾病病原谱及典型病原体—人普通冠状病毒、鼻病毒、腺病毒基因型流行特征。首先,我们对mq PCR检测方法进行了评价。经文献综述与专家咨询,明确了儿童呼吸道感染性疾病病原体36种,病毒:鼻病毒、冠状病毒（HKU1、229E、NL63、OC43）、呼吸道合胞病毒（A、B）、巨细胞病毒、EB病毒、人疱疹病毒7型、人疱疹病毒6型、单纯疱疹病毒1型、3型副流感病毒、1型副流感病毒、腺病毒、人偏肺病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、肠道病毒、博卡病毒;细菌:肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、百日咳杆菌、肺炎克雷伯氏菌、溶血性链球菌（A、B）、铜绿假单胞杆菌、嗜肺军团菌、大肠杆菌;真菌:白色念珠菌、曲霉菌;肺炎支原体;肺炎衣原体。随后,查找与自主设计上述病原体及人呼吸道上皮细胞核糖核酸酶P基因（内参基因）的引物、探针。方法评价方面,36种病原体和内参基因的引物、探针特异性良好,分为10个检测组合;引物和探针检测限为19.50-319.60copies/μL;批内和批间重复性实验结果表明,变异系数均小于5%,证明该方法具有良好的稳定性。对20例菌培养和（或）PCR-Sanger测序样本的检测结果表明,一致性达到95%。因此,我们建立了一种多重荧光定量PCR检测方法,该方法可特异、快速、准确地检测36种儿童呼吸道感染性疾病病原体。随后,我们收集了2021年云南省内儿童呼吸道感染样本1460例,使用建立的mq PCR方法,调查本省儿童呼吸道感染性疾病病原体及其分布特征。结果表明,样本阳性率为94.79%（1384例）;其中,肺炎链球菌感染率最高,为78.56%（1147例）,呼吸道合胞病毒为33.63%（491例）,流感嗜血杆菌为24.25%（354例）,卡他莫拉菌为16.44%（240例）,巨细胞病毒为16.16%（236例）,鼻病毒为13.42%（196例）,EB病毒为11.85%（173例）,金黄色葡萄球菌为10.62%（155例）;其它病原体感染率为0.34%-9.66%。EB病毒女性患儿感染率显著高于男性患儿（P=0.0063）;呼吸道感染性疾病病原体在冬、春两季检出率更高。最后,对从上述样本中筛查到的35例人普通冠状病毒（2.40%）,196例鼻病毒（13.42%）,50例腺病毒（3.42%）进行基因亚型分布调查。本省儿童呼吸道样本中筛查到HKU1 10例（0.68%）,扩增成功的3例HCoV-HKU1病毒均属于B亚型,此前本地区未有报道;229E 4例（0.27%）,NL63 13例（0.89%）,OC43 8例（0.55%）,上述3种冠状病毒因载量较低未获得序列信息。其中鼻病毒196例（13.42%）,成功分型104例,A组79例（75.96%）涉及25个基因型,B组6例（5.77%）涉及5个基因型,C组19例（18.27%）涉及11个基因型,累计检出41个基因型;其中A12型、A49型、A16型、A89型分列前四位,占比12.50%、8.65%、5.77%、4.81%,其它基因亚型占比低于4%;腺病毒50例（3.42%）,成功分型20例,且均属于C组,其中C1型12例,C2型7例,C5型1例,分别占比60.00%、35.00%、5.00%,与呼吸道腺病毒感染基因型分布特征较一致。综上所述,本论文建立了可覆盖36种儿童呼吸道感染性疾病病原体的mq PCR检测方法;纳入并调查了2021年云南省1460例儿童呼吸道感染样本病原体及其流行特征;此外,我们首次报道了在云南省发现的3例HKU1基因组特征,以及鼻病毒和腺病毒在儿童群体中基因型分布特征。本研究为儿童呼吸道感染性疾病病原体的诊断提供了新方法,为临床精准治疗提供了相关依据。
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