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我国山羊与绵羊的存栏量相当,但与绵羊相比,山羊普遍生长速度较慢,产肉力较低。因此,研究山羊肌肉生长发育调控机制,以期通过分子育种提高山羊个体产肉量,是当前山羊育种研究的热点之一。肌卫星细胞作为动物骨骼肌的主要组成成分,对骨骼肌的形成和再生具有重要意义,是研究骨骼肌体外生长发育基因调控机制的基础模型。大量研究发现,部分mi RNA在骨骼肌细胞中存在特异表达或高表达规律,能参与调控成肌过程,对于动物骨骼肌发育起到关键作用;而miR-27b是小鼠等模式动物重要的肌肉调控因子,可以抑制骨骼肌卫星细胞扩散及促进细胞分化。然而,这些研究仅集中在小鼠、人类或牛中,鲜有研究描述miR-27b在山羊骨骼肌卫星细胞中的调控作用及其机制。因此,本研究以大足黑山羊为研究对象,通过体内试验和细胞试验,研究mi R-27b在山羊不同生长阶段组织中的表达规律及对骨骼肌卫星细胞分化的影响,探究其在山羊骨骼肌生长发育中的调控功能及其作用的可能机制,以期为肉用山羊分子育种提供基础数据。本研究主要结果如下:1.miR-27b在山羊体组织中的表达规律研究。利用qRT-PCR技术检测发现,miR-27b在胚胎期3月龄、出生后0 d和24月龄山羊的心肌、肝脏、脾脏、肺、肾脏、瘤胃、小肠、背最长肌、腿肌、胸肌和臀大肌等11种组织样品中均有表达,其中在肝脏中表达量最高;进一步研究发现,随着山羊日龄的增加,mi R-27b在心肌、背最长肌、腿肌、胸肌和臀大肌等肌肉组织中的表达量逐渐下降。2.miR-27b在山羊骨骼肌卫星细胞的亚细胞定位。利用荧光原位杂交技术(FISH)对mi R-27b进行定位研究,发现探针与山羊骨骼肌卫星细胞中miR-27b结合激发出的绿色荧光大部分显示在细胞质,少部分在细胞核,表明miR-27b存在于山羊骨骼肌卫星细胞中,且在细胞质中大量表达,在细胞核中表达量较少。3.miR-27b对山羊骨骼肌卫星细胞分化的影响研究。通过分化诱导培养,可观察到山羊骨骼肌卫星细胞在不同分化阶段的形态变化,发现能形成肌管,且各阶段三个成肌标志基因(MyoD、MyoG和MyHc)稳定表达,说明本研究建立了稳定的山羊骨骼肌卫星细胞体系。进一步研究发现,miR-27b随着肌卫星细胞分化时期的延长表达量持续升高,分化2 d后的miR-27b表达量显著高于未分化的卫星细胞(P<0.05),分化4 d时的miR-27b表达量极显著高于0 d(P<0.01)。结果表明,miR-27b能有效促进山羊骨骼肌卫星细胞的分化。4.miR-27b靶标基因的筛选。本研究成功构建了miR-27b基因的过表达和干扰表达载体,并利用293T细胞制备了miR-27b过表达和干扰慢病毒(病毒滴度为6×10^8TU/m L),并摸索出最佳转染浓度,建立了山羊miR-27b过表达及干扰的骨骼肌细胞模型。利用TargetScan 7.1软件,预测并通过分子生物学技术验证了MDFI基因与mi R-27b的靶向关系,发现过表达miR-27b能够抑制MDFI基因的表达且差异极显著(P<0.01)。同时,利用miR-27b过表达及未处理骨骼肌细胞系的转录组测序分析,筛选出了55个差异表达基因,进一步挖掘了大量可能与miR-27b潜在存在靶向关系的候选基因。本研究得出如下结论:1.miR-27b在山羊多个体组织中均有表达,且在肌肉组织中的表达量随日龄增加呈逐渐下降趋势。2.miR-27b可能通过促进骨骼肌卫星细胞分化参与山羊的肌生成过程,而MDFI可能是其靶向基因。