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目的:在严重关节疾病治疗领域,人工关节置换术具有重要意义,其对恢复患者关节功能方面可提供有力支持。不过此种方法治疗后也容易出现假体晚期松动问题,相关统计研究表明在假体置换15年后,大约15%的会出现假体失效现象,以及50%的关节翻修问题。在出现假体松动情况下,通过假体翻修术进行治疗的效果不佳,同时容易出现明显的创伤,经济性也较差,因而很有必要研究非手术方式来预防上述问题,这也是目前关节外科方面的重点课题。假体失败和很多因素有关,其中最重要的为无菌性松动,其次是感染。前一种因素出现的时间相对晚,而感染主要是出现于术后早期。而假体周围骨溶解是无菌性松动发生的主要原因,假体周围骨溶解指关节置换术后出现的一种骨吸收现象,研究发现术后早期这种并发症不容易出现,同时在产生后患者没有明显的症状表现,在严重骨缺损情况下才可能被感知到,这种条件下翻修的难度和成本都明显增加,同时也容易出现更多并发症。根据临床经验可知骨溶解晚期翻修手术的疗效也不佳。已有研究显示髋关节假体早期主要是基于骨骼与关节假体的压配作用保持稳定,晚期则通过骨长入维持稳定。当假体附近的成骨细胞活性较低情况下,则无法产生新生骨,而破骨细胞增殖相对增强,这时就会引起髋关节假体周围的骨溶解,结果出现关节假体无菌性松动。鉴于此,对骨溶解病理生理机制的研究显得非常重要。明确关节假体无菌性松动过程中成骨细胞活性的调控机制有重要意义,可为这种并发症的防治提供支持和依据。目前在病理研究领域环状RNA（circ RNA）开始受到关注,其具有稳定的闭环结构,表达范围广,在机体的很多病理活动中都发挥一定调节作用。研究发现外显子来源的环形RNA可通过其上的特定结合位点进行吸附,而对目的基因的表达产生不同的影响。实验研究发现在很多骨科疾病的病理过程中其都有参与,例如骨质疏松症及关节炎等。我们通过高通量测序发现髋关节假体无菌性松动的患者假体周围组织中出现明显差异表达的circ RNA及m RNA,故由此我们进行进一步的相关功能及机制研究。研究方法:第一部分:用收集的6例临床标本组织进行高通量测序分析,筛选差异基因,从中选定目标circ RNA作为研究对象,并通过q RT-PCR验证在组织中的表达情况,通过RNase R消化实验及放线菌素D实验验证选定的circ＿0004496的稳定性。将钛粒加入成骨细胞系中共培养,并使用慢病毒构建过表达hsa＿circ＿0004496人成骨细胞系,并同时构建敲低hsa＿circ＿0004496人成骨细胞系。采用q RT-PCR方法检测成骨细胞中hsa＿circ＿0004496的表达情况及转染效率。通过对成骨细胞自噬体基于电子透镜进行观察,利用Western Blot检测人成骨细胞内LC3II/LC3I及P62蛋白表达情况。并通过Western Blot检测hsa＿circ＿0004496的过表达和敲低引起成骨细胞标志蛋白ALP、骨钙素（osteocalcin）、RUNX2的表达变化。通过ALP活性实验检测hsa＿circ＿0004496的过表达和敲低组的人成骨细胞内ALP活性变化,从而反应对人成骨细胞的活性的影响。CCK-8实验、细胞克隆形成实验检测hsa＿circ＿0004496对人成骨细胞的增殖能力的影响。流式细胞术检测对细胞凋亡的影响。第二部分:首先用生物信息学方法建立circ＿0004496/let-7b-5p/ATG7调控网络,Fish实验验证circ＿0004496与let-7b-5p在细胞中的定位,并用双荧光素酶基因报告实验验证circ＿0004496与let-7b-5p、let-7b-5p与ATG7之间相互结合,再用RIP实验进一步验证circ＿0004496和let-7b-5p直接结合,通过组织q RT-PCR验证let-7b-5p与ATG7在假体松动组织中的表达情况。细胞实验验证circ＿0004496与let-7b-5p,let-7b-5p与ATG7之间的调控关系,然后进一步通过Western Blot检测自噬蛋白及成骨细胞标志蛋白表达情况,并通过CCK-8实验、细胞克隆形成实验、ALP活性实验、流式细胞凋亡实验验证let-7b-5及ATG7在成骨细胞中影响自噬、增殖、分化、凋亡等表型变化。第三部分:研究成骨细胞内circ＿0004496通过ce RNA机制内源竞争性结合let-7b-5p调控ATG7激活成骨细胞自噬从而干预假体周围骨溶解的发生:构建过表达hsa＿circ＿0004496+上调let-7b-5p共转染细胞系,并构建敲低hsa＿circ＿0004496+下调let-7b-5p共转染细胞系,并同时构建过表达hsa＿circ＿0004496+敲低ATG7共转染细胞系以及敲低hsa＿circ＿0004496+过表达ATG7共转染细胞系,通过Western Blot检测各转染分组对ATG7、ALP、骨钙素（osteocalcin）、RUNX2的表达变化以及自噬蛋白LC3II/LC3I与P62表达情况。再通过ALP活性实验、CCK-8、细胞克隆形成实验、流式细胞术检测对于人成骨细胞活性和细胞增殖、凋亡等能力的影响。最后建立小鼠胫骨骨溶解模型,同源性转换人属circ RNA到小鼠circ RNA:mmu-circ＿0004496,然后通过将构建的转染过表达mmu-circ＿0004496小鼠成骨细胞注射入胫骨骨溶解模型小鼠关节腔内,5周后通过micro-CT查看小鼠骨质变化情况,并检测骨矿物质密度变化。最后取小鼠骨溶解模型胫骨Ti棒周边骨溶解组织做Western Blot实验检测ATG7变化及成骨细胞标志蛋白的变化。结果:第一部分:通过高通量测序在无菌性松动组织中筛选差异表达的circ RNAs,我们从所得结果中选定hsa＿circ＿0004496为本研究的目标circ RNA,通过组织q RT-PCR验证结果与测序结果一致。通过放线菌素D实验验证及RNase R消化实验证实hsa＿circ＿0004496的环状稳定性。在与Ti颗粒共培养的人成骨细胞系中采用q RT-PCR检测结果显示circ＿0004496呈下调趋势,并Western Blot检测成骨细胞标志蛋白ALP、骨钙素、RUNX2均呈下调趋势。透射电镜结果见hsa＿circ＿0004496过表达组中自噬体的数目较对照组明显增多。通过Western Blot检测结果可见在hsa＿circ＿0004496过表达组中LC3 II/LC3I的比值明显高于对照组,P62蛋白表达量明显低于对照组;hsa＿circ＿0004496敲减组与对照组相比LC3II/LC3 I比值降低明显,P62蛋白表达与对照组相比也显著增高。当hsa＿circ＿0004496过表达时成骨细胞标志蛋白ALP、骨钙素、RUNX2的表达相应升高,当hsa＿circ＿0004496低表达时蛋白ALP、骨钙素、RUNX2的表达相应降低。ALP活性实验中,与对照组相比碱性磷酸酶活性在hsa＿circ＿0004496过表达组中明显升高,而在hsa＿circ＿0004496敲减组中碱性磷酸酶活性较对照组明显降低。CCK-8实验及细胞克隆形成实验检测在hsa＿circ＿0004496过表达组较对照组促进了成骨细胞增殖;而敲减hsa＿circ＿0004496后,人成骨细胞增殖能力减弱。流式细胞术检测细胞凋亡率,hsa＿circ＿0004496过表达组的人成骨细胞中,细胞凋亡率明显低于对照组,而在hsa＿circ＿0004496敲低组中细胞凋亡率明显高于对照组。以上所有实验结果均具有显著统计学差异。第二部分:通过生物信息学技术建立hsa＿circ＿0004496/let-7b-5p/ATG7调控网络。FISH实验验证hsa＿circ＿0004496与let-7b-5p共定位于细胞质。双荧光素酶基因报告实验结果显示hsa＿circ＿0004496及ATG7均可以与let-7b-5p直接结合。RIP实验表明hsa＿circ＿0004496可以与let-7b-5p直接结合。q RT-PCR实验检测可见假体松动组织中let-7b-5p呈高表达、而ATG7呈低表达。人成骨细胞系中q RT-PCR检测发现在hsa＿circ＿0004496过表达组与对照组相比,let-7b-5p的表达降低,ATG7表达量升高;在hsa＿circ＿0004496敲低组与对照组相比,let-7b-5p的表达升高,ATG7表达量降低。人成骨细胞系中q RT-PCR检测发现在let-7b-5p过表达组与对照组相比,ATG7的表达降低;在let-7b-5p敲低组与对照组相比,ATG7表达量升高。以上所有实验结果均具有明显统计学意义。Western Blot实验检测自噬相关蛋白,在let-7b-5p敲低组中,LC3 II/LC3I的比值明显高于对照组,P62蛋白表达量明显低于对照组;然而let-7b-5p过表达组与对照组相比LC3 II/LC3 I比值降低明显,P62蛋白表达与对照组相比显著增高。通过Western Blot检测在let-7b-5p下调组中,与NC对照组相比,ATG7、ALP、骨钙素、RUNX2均表达增高;相反的,上调let-7b-5p后,ATG7、ALP、骨钙素、RUNX2表达均降低。ALP活性实验中,与对照组相比碱性磷酸酶活性在let-7b-5p敲低组中明显升高,而let-7b-5p过表达组中碱性磷酸酶活性较对照组明显降低。CCK-8实验及细胞克隆形成实验检测在let-7b-5p敲低组促进人成骨细胞增殖;而过表达let-7b-5p后,抑制人成骨细胞增殖。细胞凋亡实验结果显示let-7b-5p下调组能够抑制细胞凋亡率,let-7b-5p上调组能增加细胞的凋亡率。以上所有实验结果均具有统计学意义。Western Blot实验检测自噬相关蛋白,在ATG7过表达组中,LC3II/LC3I的比值明显高于对照组,P62蛋白表达量明显低于对照组;然而在ATG7敲低组与对照组相比LC3II/LC3I比值降低明显,P62蛋白表达显著高于对照组的。同样的蛋白质印迹法检测分析,和对照组相比,过表达ATG7组的ATG7、ALP、骨钙素、RUNX2均表达增高;相反的,敲低ATG7组中,ATG7、ALP、骨钙素、RUNX2表达均降低。ALP活性实验中,与对照组相比碱性磷酸酶活性在ATG7过表达组中大幅度提高,而ATG7敲低组中其活性明显降低。CCK-8实验及细胞克隆实验检测在ATG7过表达组促进了人成骨细胞增殖,而敲低ATG7后抑制了人成骨细胞增殖。细胞凋亡实验结果显示过表达ATG7组能够抑制细胞凋亡率,敲低ATG7组能增加细胞的凋亡率。以上所有实验结果均具有统计学意义。第三部分:（1）在过表达hsa＿circ＿0004496和上调let-7b-5p共转染细胞系中,上调let-7b-5p能够逆转因过表达hsa＿circ＿0004496对ATG7的上调作用。相反的,在敲低hsa＿circ＿0004496和下调let-7b-5p共转染细胞系中,q RT-PCR实验检测结果显示下调let-7b-5p可以逆转因敲低hsa＿circ＿0004496对ATG7的下调作用。Western Blot实验中,在过表达hsa＿circ＿0004496和上调let-7b-5p细胞系中,上调let-7b-5p能够逆转因过表达hsa＿circ＿0004496对靶蛋白ATG7的上调作用。相反的,在敲低hsa＿circ＿0004496和下调let-7b-5p共转染细胞系中,Western Blot实验检测结果显示下调let-7b-5p可以逆转因敲低hsa＿circ＿0004496对靶蛋白ATG7的下调作用。上调let-7b-5p能够逆转因过表达hsa＿circ＿0004496对自噬相关蛋白LC3I到LC3II的转化率升高,并逆转P62蛋白表达量降低。相反的,下调let-7b-5p可以逆转因敲低hsa＿circ＿0004496对自噬相关蛋白LC3I-LC3II的转化率的下降,并逆转P62蛋白表达量增高。上调let-7b-5p能够逆转因过表达hsa＿circ＿0004496对成骨细胞标志蛋白ALP、骨钙素、RUNX2的上调。相反的,下调let-7b-5p可以逆转因敲低hsa＿circ＿0004496对成骨细胞标志蛋白ALP、骨钙素、RUNX2的下调。CCK-8实验及细胞克隆形成实验中,上调let-7b-5p能够逆转过表达hsa＿circ＿0004496对成骨细胞增殖的促进作用。相反的,在敲低hsa＿circ＿0004496和下调let-7b-5p共转染细胞系中,下调let-7b-5p可以逆转因敲低hsa＿circ＿0004496对成骨细胞增殖的抑制作用。流式细胞术检测细胞凋亡率,上调let-7b-5p能够逆转因过表达hsa＿circ＿0004496对凋亡率的抑制作用。相反的,下调let-7b-5p可以逆转因敲低hsa＿circ＿0004496对凋亡率的促进作用。以上所有实验结果均具有统计学意义。Western Blot实验示在过表达hsa＿circ＿0004496和敲低ATG7共转染细胞系中,敲低ATG7能够逆转因过表达hsa＿circ＿0004496对自噬相关蛋白LC3I到LC3II的转化率升高,并逆转P62蛋白表达量降低。相反的,过表达ATG7可以逆转因敲低hsa＿circ＿0004496对自噬相关蛋白LC3I-LC3II的转化率的下降,并逆转P62蛋白表达量增高。敲低ATG7能够逆转因过表达hsa＿circ＿0004496对成骨细胞标志蛋白ALP、osteocalcin、RUNX2的上调。相反的,过表达ATG7可以逆转因敲低hsa＿circ＿0004496对成骨细胞标志蛋白ALP、osteocalcin、RUNX2的下调作用。CCK-8实验及细胞克隆形成实验中,敲低ATG7能够逆转因过表达hsa＿circ＿0004496对成骨细胞增殖的促进作用。相反的,在敲低hsa＿circ＿0004496和过表达ATG7共转染细胞系中,过表达ATG7可以逆转因敲低hsa＿circ＿0004496对成骨细胞增殖的抑制作用。流式细胞术检测细胞凋亡率,敲低ATG7能够逆转因过表达hsa＿circ＿0004496对凋亡的抑制作用。相反的,过表达ATG7可以逆转因敲低hsa＿circ＿0004496对细胞凋亡的促进作用。以上所有实验结果均具有统计学意义。（2）动物实验:micro-CT中可见对照组比过表达mmu-circ＿0004496组中原Ti棒通道周围的皮质变薄更明显、种植体周围小梁骨损失增多。且过表达mmu-circ＿0004496组比对照组骨矿物质密度升高。最后取小鼠胫骨近端靠近Ti棒周边的骨溶解组织的Western Blot检测示蛋白ATG7、ALP、骨钙素、RUNX2的表达量在过表达mmu-circ＿0004496组明显高于对照组。以上实验结果均具有统计学意义。结论:环状RNA hsa＿circ＿0004496介导let-7b-5p/ATG7通路参与正向调控成骨细胞自噬,抑制细胞凋亡,促进成骨细胞活性和增殖,并负向干预人工假体周围骨溶解效应。