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猪轮状病毒病是由猪轮状病毒(Porcine Rotavirus, PoRV)引起的一种腹泻性疾病,主要引起仔猪腹泻、呕吐、脱水等。猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的一种高度接触性肠道传染病,主要引起猪群呕吐、水样腹泻和严重脱水等,尤其对哺乳仔猪有极高致死率。临床上两种病毒常混合感染,极大提高仔猪感染后病死率,给养猪业带来巨大经济损失。目前,针对上述病毒尚无特效药治疗,为了预防和控制这些疾病,安全、高效的疫苗研究是首要解决途径。1 PoRV VP7、PEDV S目的基因的克隆及生物信息学分析本实验根据Genbank收录的PoRV OSU代表株(登录号KJ450849)和PEDV CV777株(AF353511)全基因分别设计1对引物VP7-a/VP7-b和S-a/S-b。经RT-PCR从PoRVSC-R毒株、PEDV SC-P毒株RNA样品中分别扩增出长度986 bp、989 bp的基因片段。经连接、转化等克隆至PMD19-T (Simple)载体,成功构建了PMD-VP7、PMD-S质粒,并经PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定证明克隆片段正确。利用MEGA 5.0等软件分别对PoRV SC-R株VP7、PEDV SC-P株S基因与Genbank参考序列进行同源性分析并构建进化树。结果表明,VP7基因同32株世界各地轮状病毒参考株同源性为94.9%-98.7%,S基因同38株世界各地参考株同源性为94.7%-98.8%。利用不同生物学软件分别对PoRV VP7、PEDV S目的基因编码氨基酸进行理化性质、疏水性、跨膜区域、信号肽、抗原决定簇预测等分析,结果表明本实验扩增的PoRV VP7、PEDV S目的基因均具有良好的免疫原性。2联合表达PoRV VP7、PEDV S基因真核表达载体的构建分别对PMD-VP7重组质粒和pPI-2.EGFP真核表达载体进行EcoR I、Kpn I双酶切反应,回收目的片段并经连接、转化,成功构建了pPI-2.EGFP.VP7重组质粒。分别对PMD-S和pPI-2.EGFP.VP7重组质粒进行Kpn I、BamH I双酶切,回收目的片段并经连接、转化,成功构建了pPI-2.EGFP.VP7.S重组质粒,并对其进行酶切鉴定、PCR鉴定和测序鉴定。3 pPI-2.EGFP.VP7.S重组质粒的体外表达检测将pPI-2.EGFP.VP7.S重组质粒转染至BHK-21细胞,24 h后可见有绿色荧光蛋白表达。取转染后48 h细胞抽提总RNA并进行RT-PCR反应,可分别扩增出同VP7、S目的基因及VP7-S融合基因大小相当的片段,表明pPI-2.EGFP.VP7.S转染BHK-21细胞后成功转录。取转染后60 h细胞样品进行Western blotting检测,结果显示pPI-2.EGFP.VP7.S在BHK-21细胞中成功表达,其表达蛋白分子量约为98 KDa,且具有良好的反应原性。4 pPI-2.EGFP.VP7.S在小鼠体内的动态分布及安全性研究将pPI-2.EGFP.VP7.S重组质粒以100μg/只肌肉注射小鼠后,采集不同时期不同组织抽提DNA并进行VP7-S融合基因的PCR检测。结果表明,pPI-2.EGFP.VP7.S核酸疫苗经肌肉注射免疫小鼠后3 h可到达心脏、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏、脑和血液等部位,在脑部可存留42 d,在心脏、血液中存留63 d以上,在注射部位肌肉可存留91 d以上。此外,对免疫小鼠不同时期不同组织进行DNA抽提并纯化,结果发现纯化后样品均未扩增出VP7-S条带,表明pPI-2.EGFP.VP7.S不与宿主染色体DNA整合,从而具有较好的安全性。5 pPI-2.EGFP.VP7.S二联核酸疫苗的免疫效果研究将重组质粒以不同剂量、不同途径、不同佐剂免疫小鼠,分别于首免前0 d及首免后7 d,14 d,21 d,28 d,42 d采集血清进行PoRV和PEDV抗体IgG检测；首免后42 d采集血清进行细胞因子IFN-γ、IL-4检测；首免前0 d及首免后14 d,28 d,42 d采集脾脏进行脾淋巴细胞增殖实验。综合比较各指标检测结果表明,相比50μg肌注组和100μg肌注组,200μg肌注组免疫效果较好；相比100μg皮下注射组,100μg肌注组免疫效果较好；相比100 μg肌注组,IFN-a佐剂组免疫效果较好,脾转移因子佐剂组和IL-12佐剂组次之,但均优于100μg肌注组。