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目的:心肌细胞增殖和凋亡是维持心脏组织形态相对稳定不可缺少的细胞学基础,两者间平衡的破坏将会导致心脏缺陷的发生。探讨心脏疾病候选基因对心肌细胞增殖和凋亡的影响,有助于阐明相关基因参与疾病发生的可能机制,为临床疾病的治疗、预防或干预提供新的思路。Tbx20基因是心脏疾病重要的候选基因。本课题组前期研究证明Tbx20基因表达降低能够促进心肌细胞凋亡,抑制心肌细胞增殖,使细胞周期阻滞于G2期。Tbx20基因通过负调控下游靶基因Lta基因表达参与心肌细胞凋亡。通过免疫共沉淀技术证明了Tbx20蛋白和cTnI蛋白之间存在相互作用,但两者相互作用对Tbx20基因功能的影响及其机制尚未见报道。cTnI蛋白是肌钙蛋白复合物的抑制性亚基,在心肌收缩和舒张中起核心作用。编码cTnI蛋白的基因为Tnni3基因。Tnni3基因功能丧失性致病突变可引起Tnni3基因表达降低,常见于各类心脏疾病患者,提示Tnni3基因表达降低在疾病的发病过程中扮演重要角色,但具体机制尚不清楚。因此,本研究以大鼠心肌细胞H9C2为细胞模型,首先通过RNA干扰实验,探讨Tnni3基因表达降低对心肌细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期等生物学特性的影响;其次通过共转染和荧光素酶报告系统,探讨Tnni3基因和Tbx20基因共同作用对Tbx20基因功能（如参与心肌细胞凋亡、调控Lta基因表达）的影响,为深入理解心脏疾病病因学奠定基础,也为探索疾病治疗新方法提供理论依据。研究方法:培养大鼠心肌细胞H9C2,分为4组:阴性对照小干扰RNA（NC-siRNA）组、Tnni3-siRNA组、Tbx20-siRNA组以及共转染Tnni3-siRNA和Tbx20-siRNA组。分别于转染48h、72h后收集细胞,实时定量PCR和Western Blot检测Tnni3基因、Tbx20基因、Caspase3基因、PCNA基因、CyclinA1基因、CyclinB1基因和Lta基因表达水平。Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测早期细胞凋亡,DeadEndTM Fluorometric TUNEL System检测晚期细胞凋亡,CCK-8试剂盒检测细胞增殖,PI单染结合流式细胞仪检测细胞周期的变化,Dual-Luciferase Reporter System检测Lta基因启动子荧光素酶活性。结果:1.与转染NC-siRNA组相比,转染Tnni3-siRNA 48h后,Tnni3 mRNA和蛋白表达水平显著降低（P<0.01）,提示Tnni3-siRNA能够有效抑制Tnni3基因表达。2.与转染NC-siRNA组相比,转染Tnni3-siRNA 72h后,早期凋亡细胞增加,晚期凋亡小体增多,H9C2细胞凋亡率明显增加（P<0.01）,Caspase3 mRNA和蛋白表达水平显著升高（P<0.01）,提示Tnni3基因表达降低能够促进心肌细胞凋亡。3.与转染NC-siRNA组相比,转染Tnni3-siRNA组表现为显著的时间依赖性细胞增殖能力降低。转染Tnni3-siRNA 72h后,PCNA mRNA和蛋白表达水平显著降低（P<0.01）,提示Tnni3基因表达降低能够抑制心肌细胞增殖。4.转染Tnni3-siRNA 72h后,G1期、S期和G2期细胞比例分别为（71.25±3.82）%、（18.28±2.78）%和（9.94±1.09）%。与转染NC-siRNA组相比,转染Tnni3-siRNA组G2期细胞比例明显增加（P<0.01）,CyclinA1 mRNA和蛋白表达水平显著升高（P<0.05）而CyclinB1 mRNA和蛋白表达水平显著降低（P<0.05）,提示Tnni3基因表达降低能够使细胞周期重新分布,并阻滞于G2期。5.与单独转染Tnni3-siRNA或Tbx20-siRNA相比,共转染Tnni3-siRNA和Tbx20-siRNA 72h后,早期凋亡细胞增加,晚期凋亡小体增多,H9C2细胞凋亡率明显增加（P<0.01）,Caspase3蛋白表达水平显著升高（P<0.05）,提示Tnni3基因表达降低协同Tbx20基因表达降低,促进心肌细胞凋亡。6.与单独转染Tnni3-siRNA或Tbx20-siRNA相比,共转染Tnni3-siRNA和Tbx20-siRNA 72h后,Lta mRNA表达水平显著升高（P<0.01）,野生型Lta启动子荧光素酶活性显著升高（P<0.01）而突变型Lta启动子荧光素酶活性无变化（P>0.05）,提示Tnni3基因协同Tbx20基因调控Lta基因表达。结论:1.Tnni3基因表达降低能够促进心肌细胞凋亡,抑制心肌细胞增殖,使细胞周期阻滞于G2期。2.Tnni3基因协同Tbx20基因调控Lta基因表达,参与心肌细胞凋亡。