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目的:
本研究通过观察儿茶素(epigallocatechin gallate,EGCG)对泡沫细胞的自噬及胆固醇外流的调控作用,深入探讨其对巨噬细胞泡沫化的改善作用,以及对动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的保护性作用及潜在机制。
方法:
选择THP1(人白血病单核细胞)为研究巨噬细胞泡沫化的工具细胞;采用CCK8检测不同浓度(0、1、5、10、15、25、30、35、40μmol/L)EGCG对巨噬细胞增殖活力的影响;根据氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein ,ox-LDL)及EGCG干预与否将巨噬细胞分为空白对照组(无ox-LDL处理)、处理组(巨噬泡沫细胞模型组,ox-LDL处理)及干预组(EGCG预处理24h后ox-LDL处理)三组细胞;通过油红O染色检测三组细胞的脂质蓄积的变化;采用Westernblot及RT-PCR检测三组(对照组、处理组、干预组)细胞中SIRT1和自噬基因(LC3Ⅰ/Ⅱ、ATG5)的mRNA和蛋白表达量以及胆固醇流出介导蛋白ABCA1的蛋白表达量变化;采用胆固醇外流检测试剂盒对三组细胞的胆固醇进行荧光标记,通过荧光酶标仪观察波长,计算出三组细胞内胆固醇流出率;最后通过构建过表达SIRT1(Lv-SIRT1)THP1稳转细胞株,在蛋白水平检测巨噬泡沫细胞的自噬基因和胆固醇流出介导蛋白的表达。
结果:
一、油红O染色结果显示有明显脂滴聚集,说明成功构建巨噬泡沫细胞模型;
二、CCK8的结果显示1-25μmol/L的EGCG对巨噬细胞活性无影响;
三、Westernblot和RT-PCR结果显示,处理组相较于空白对照组中SIRT1和自噬基因表达量均明显降低;而干预组的SIRT1表达量和自噬水平相较于泡沫细胞组明显增加;Westernblot显示干预组泡沫细胞的胆固醇流出介导蛋白ABCA1蛋白水平相较于处理组明显升高;
四、油红O染色结果显示干预组泡沫细胞脂质蓄积相较于处理细胞组明显减少;
五、EGCG干预组较处理组的胆固醇流出率明显增加;
六、过表达SIRT1基因的泡沫细胞相较于过表达空载慢病毒的泡沫细胞胆固醇流出增加,且其自噬障碍可被明显改善;
结论:EGCG可改善巨噬细胞因摄取ox-LDL泡沫化过程中的自噬障碍,同时EGCG可促进泡沫细胞胆固醇外流,减轻巨噬细胞泡沫化,EGCG改善巨噬细胞泡沫化可能与上调SIRT1的表达有关。
本研究通过观察儿茶素(epigallocatechin gallate,EGCG)对泡沫细胞的自噬及胆固醇外流的调控作用,深入探讨其对巨噬细胞泡沫化的改善作用,以及对动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的保护性作用及潜在机制。
方法:
选择THP1(人白血病单核细胞)为研究巨噬细胞泡沫化的工具细胞;采用CCK8检测不同浓度(0、1、5、10、15、25、30、35、40μmol/L)EGCG对巨噬细胞增殖活力的影响;根据氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein ,ox-LDL)及EGCG干预与否将巨噬细胞分为空白对照组(无ox-LDL处理)、处理组(巨噬泡沫细胞模型组,ox-LDL处理)及干预组(EGCG预处理24h后ox-LDL处理)三组细胞;通过油红O染色检测三组细胞的脂质蓄积的变化;采用Westernblot及RT-PCR检测三组(对照组、处理组、干预组)细胞中SIRT1和自噬基因(LC3Ⅰ/Ⅱ、ATG5)的mRNA和蛋白表达量以及胆固醇流出介导蛋白ABCA1的蛋白表达量变化;采用胆固醇外流检测试剂盒对三组细胞的胆固醇进行荧光标记,通过荧光酶标仪观察波长,计算出三组细胞内胆固醇流出率;最后通过构建过表达SIRT1(Lv-SIRT1)THP1稳转细胞株,在蛋白水平检测巨噬泡沫细胞的自噬基因和胆固醇流出介导蛋白的表达。
结果:
一、油红O染色结果显示有明显脂滴聚集,说明成功构建巨噬泡沫细胞模型;
二、CCK8的结果显示1-25μmol/L的EGCG对巨噬细胞活性无影响;
三、Westernblot和RT-PCR结果显示,处理组相较于空白对照组中SIRT1和自噬基因表达量均明显降低;而干预组的SIRT1表达量和自噬水平相较于泡沫细胞组明显增加;Westernblot显示干预组泡沫细胞的胆固醇流出介导蛋白ABCA1蛋白水平相较于处理组明显升高;
四、油红O染色结果显示干预组泡沫细胞脂质蓄积相较于处理细胞组明显减少;
五、EGCG干预组较处理组的胆固醇流出率明显增加;
六、过表达SIRT1基因的泡沫细胞相较于过表达空载慢病毒的泡沫细胞胆固醇流出增加,且其自噬障碍可被明显改善;
结论:EGCG可改善巨噬细胞因摄取ox-LDL泡沫化过程中的自噬障碍,同时EGCG可促进泡沫细胞胆固醇外流,减轻巨噬细胞泡沫化,EGCG改善巨噬细胞泡沫化可能与上调SIRT1的表达有关。