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目的:桑椹是中医临床常用中药。本课题的目的在于建立桑椹药材及其颗粒制剂的质量标准,明确桑椹及其颗粒制剂中的活性成分,阐明其对糖尿病并发心肌损伤的保护作用及作用机制,为桑椹的进一步开发和利用提供理论和实验基础。 方法: 1.桑椹药材质量标准研究:通过理化性质等试验研究方法,检测桑椹中水分、灰分、浸出物含量,高效液相色谱法(HPLC)测定绿原酸含量,为制定桑椹质量标准提供方法学支持。 2.桑椹颗粒质量标准研究:采用薄层色谱鉴别法(TLC)对制剂中绿原酸进行定性鉴别;采用HPLC对10个不同产地的桑椹制备的颗粒剂进行了成分分析,结合已知的对照品进行比对研究,建立桑椹颗粒的质量标准。 3.桑椹颗粒药理学研究:C57BL/6小鼠腹腔注射(ip)链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病模型,在此基础上,心肌缺血30 min,再灌注24 h,模拟糖尿病合并心肌缺血再灌注损伤模型,桑椹颗粒灌胃(ig)给药一个月,测定心功能参数、计算心肌梗死面积、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)以及抗氧化蛋白酶活性,蛋白印迹法测定AMPK和Nrf2的表达,探讨其改善糖尿病心肌损伤的作用及其机制。 结果: 1.参照《中国药典》2015年版一部标准和要求,桑椹药材质量标准的主要指标确定为水分不超过18.0%、总灰分不超过12.0%、浸出物(用85%乙醇作溶剂)不得少于15.0%、绿原酸含量不低于0.02%。 2.桑椹颗粒薄层色谱鉴别具有良好的专属性;桑椹颗粒中绿原酸的线性回归方程Y=42256X-9219.6,r=0.9994,线性范围为1.300~312.000μg·mL-1;平均回收率为96.62%,RSD值为1.05%。 3.桑椹颗粒对糖尿病合并心肌缺血再灌注损伤具有明确的药理作用:①明显调节糖尿病小鼠体内血糖、胰岛素和脂质水平和改善胰岛素抵抗;②显著保护糖尿病合并心肌缺血再灌注损伤,改善心功能参数,减少心肌梗死面积;③桑椹颗粒预处理后,显著升高心肌组织内抗氧化酶(GSH、SOD、CAT和GR)水平,显著增加Nrf2蛋白表达。 4.桑椹颗粒保护糖尿病合并心肌缺血再灌注损伤的作用机制:基于:①在Nrf2蛋白敲除的小鼠体内未观察到相同的保护作用,则说明桑椹颗粒通过Nrf2蛋白发挥作用;②桑椹颗粒能够剂量依赖性的促进AMPK蛋白磷酸化,而敲除AMPK后桑椹颗粒的保护作用减弱,同时Nrf2蛋白表达减少;说明桑椹颗粒通过激活AMPK/Nrf2信号通路,调节机体抗氧化酶活性,从而有效保护糖尿病心肌损伤。 结论: 1.分析桑椹中绿原酸成分并建立了桑椹药材及其颗粒制剂中绿原酸含量检测方法及其HPLC法检测分析技术,为提高和客观评价桑椹及其颗粒制剂的质量提供了理论和技术支持; 2.证实我国不同产地的桑椹中绿原酸等成分的含量差异大,表明其品质具有显著的地域特点,即向阳、雨水多(江苏产地)有利于桑椹药材有效成分的积累; 3.证明桑椹颗粒对糖尿病合并缺血再灌注心肌损伤具有显著预防和保护作用,其机制与激活AMPK/Nrf2信号通路,调节机体抗氧化酶活性密切相关。