基于碳点分子印迹识别材料的革兰氏阴性菌信号分子(AHLs)快速检测技术研究

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细菌性食品污染不仅会导致食物资源浪费,而且会造成严重的公共卫生安全隐患,针对细菌性食品污染的防控问题亟待解决。群体感应(Quorum Sensing,QS)系统及其信号分子的揭示可为细菌性食品污染的防控提供新思路。N-酰基-高丝氨酸内脂(N-acyl-homoserine Lactones,AHLs)是调控革兰氏阴性菌QS系统最典型的信号分子,开发新型的AHLs快速检测技术,可有效简化检测程序、缩短分析时间,对阐明食品腐败过程中QS系统调控机制以及开发新型防控策略具有重要意义。基于此,本文将分子印迹技术与荧光纳米材料结合,开发了一种新型的荧光分子印迹识别材料,基于该材料构建了快速、高效检测AHLs的分析方法,主要内容概述如下:制备一种可作为荧光识别元件的碳点(Carbon Dots,CDs),并对其光学性能及信号转导性能进行探究。以2,5-二氨基苯磺酸作为单一碳前体物,采用一步水热法合成了N,S共掺杂的CDs,470~520 nm的激发波长下,在593 nm处显示出激发不依赖特征的荧光峰。通过对CDs的形貌、光学性能以及结构的表征,发现CDs粒径均匀,光学性质优异,且由于N,S杂原子的掺杂为CDs表面引入了丰富的官能团(氨基、羟基、巯基),并赋予了其独特的传感性能。通过构建一种“switch-on”的荧光传感器进一步验证了所制备CDs可作为荧光识别元件的潜在价值。将分子印迹聚合物(Molecular Imprinting Polymers,MIPs)的高选择性与CDs灵敏的信号转导特性相结合,开发了一种基于荧光分子印迹识别材料的AHLs快速检测方法。以2,5-二甲基-4-羟基-3(2H)-呋喃酮(2,5-dimethyl-4-hydroxy-3(2H)-furanone,DMHF)作为模板分子,采用溶胶-凝胶法制备了荧光分子印迹聚合物(CD@MIP),模板洗脱后,CD@MIP表面形成的印迹空腔能够选择性地识别AHLs,并显示出良好的荧光响应。在最佳荧光检测条件下,随着模板分子浓度增加,荧光猝灭效率F0/F逐渐增大,在0~2.0μM的浓度范围内呈良好的线性关系,最低检出限(Limit of Detection,LOD)为0.0672μM(S/N=3)。利用该方法探究了5种细菌上清液中的AHLs,除大肠杆菌和金黄色葡萄球菌外,其他细菌上清液均产生了荧光响应,该结果与这两种细菌不产AHLs的特性一致;并对无菌上清液进行了加标回收实验,回收率范围为95.3%~103.0%,证明了该方法的可行性。为了进一步提高检测效率,构建了用于AHLs高效检测的CD@MIP微孔板。将成功制备的荧光分子印迹识别材料“枝接”于96孔板的微孔内,通过对制备条件和吸附介质的优化,成功制备了用于AHLs高效检测的CD@MIP微孔板,并对其吸附性能进行了评价。使用CD@MIP微孔板对四种AHLs信号分子进行了定量检测,C4-HSL、C6-HSL、3-O-C6-(L)-HSL、C8-HSL浓度的对数值均与荧光猝灭效率F0/F呈现良好线性关系,线性范围为0~25μM,LOD(S/N=3)分别计算为0.0643μM、0.0657μM、0.0729μM、0.0745μM。采用该微孔板对细菌上清液进行了加标回收实验,加标回收率范围为96.1%~103.0%,证明该方法具有良好的准确性和稳定性。
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