【摘 要】
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丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)是输血后及散在性的非甲非乙型肝炎(Non-A,Non-B Hepatitis,NANBH)主要病因.缺乏可以在实验室内稳定扩增病毒的细胞系统和动物模型严重
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丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)是输血后及散在性的非甲非乙型肝炎(Non-A,Non-B Hepatitis,NANBH)主要病因.缺乏可以在实验室内稳定扩增病毒的细胞系统和动物模型严重阻碍了HCV病毒本身的研究发展和由其感染引起的疾病的治疗方法的研究进步.各国科学家一方面致力于扩增病毒的细胞系和动物模型的发展,另一方面利用分子生物学的手段对HCV开展了基础性的研究.在如今分子生物学研究发展迅猛的背景下,HCV的研究水平也很快得到了很大提高.结构蛋白的研究有利于病毒粒子结构、病毒组装和病毒入侵机理等基础性研究的发展,同时为发展新一代预防及治疗性疫苗奠定了基础.该研究利用Bac-to-Bac重组杆状病毒表达系统在昆虫细胞系Sf21细胞中得到了HCV结构蛋白的成功表达,并在人宫颈癌细胞系HeLa细胞中检测到了E1区基因的转录.电镜观察结果表明,vAcHCVsp1感染的Sf21细胞96h时在细胞质中可见很多空泡,其中含有由HCV结构蛋白组装而形成的直径约50nm的球形颗粒.另外我们通过瞬时转染筛选得到了可以稳定表达HCV蛋白的人肝癌细胞系SMMC-7721细胞克隆.该论文包括以下三个章节:第一章对HCV的发现、其分子生物学特征及HCV结构蛋白和由其组装成的类病毒颗粒的特征及研究进展做了简要综述,对利用杆状病毒表达系统表达外源蛋白的广泛应用作了简要介绍,并对建立高效的HCV自主复制系统的研究进展进行了概述.第二章描述了两个用于表达HCV结构蛋白的重组杆状病毒(vAcHCVsp1和vAcHCVsp2)的构建,利用vAcHCVsp1在Sf21细胞中得到了HCV结构蛋白的成功表达,我们还对Sf21细胞中HCV RNA转录和蛋白质表达的时相进行了分析,发现在感染后16h开始转录,而蛋白质表达则是在感染后48h可以检测到,72h达最高峰,之后开始下降.电镜观察结果表明,vAcHCVsp1感染的Sr21细胞96h时在细胞质中可见很多空泡,其中含有由HCV结构蛋白组装而形成的直径约50nm的球形颗粒.vAcHCVsp2可转导哺乳动物细胞,在人宫颈癌细胞系HeLa中检测到HCV基因的转录.第三章介绍了通过瞬时转染筛选得到可以稳定表达HCV蛋白的人肝癌细胞系SMMC-7721细胞克隆.通过提取转染后细胞总mRNA反转录后用HCV E1区的特异性引物进行PCR结果表明HCV基因在细胞中可以发生转录,用抗Core的单克隆抗体进行的Western-Blot分析表明HCV Core蛋白可以在细胞克隆中被表达,另外免疫荧光标记发也表明细胞克隆确可以成功表达HCV蛋白.
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