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猪的人工授精技术极大地提升了其繁殖效率,该技术的核心环节之一是精液的体外保存。猪精液在液态保存时由于72 h内质量明显下降、运输易造成精子应激等问题,限制了其应用范围。冷冻保存能使猪精液的应用突破时间和空间的限制。然而,在冷冻过程中,猪精子容易受到低温应激和活性氧（Reactive oxygen species,ROS）蓄积等的损伤,致使解冻后精子的质量明显下降,但其具体损伤机制至今仍不明确。卵黄的有效成分卵磷脂能与精子的质膜融合,改变质膜的相变温度,从而降低精子对低温的敏感性,但其不均匀质地会影响该效果;甲壳素的去乙酰产物壳聚糖能结合ROS中的羟自由基,减少精子液态保存时的氧化损伤;蜂蜜作为天然的抗氧化剂,能够改善精子的受精能力。因此,本试验通过检测猪精液冷冻保存主要环节中精子特性,以及氧化损伤和线粒体功能指标等,旨在筛选出引起猪冷冻精液质量下降的关键环节;通过添加匀浆卵黄、壳聚糖和蜂蜜,优化冻存方案,并对解冻精液的体外受精能力进行鉴定,以期建立高效的猪精液冷冻保存方法,促进猪冷冻精液的产业化应用推广。试验一猪精液冷冻保存损伤关键环节的筛选本试验以猪鲜精作为对照,通过比较25℃平衡、离心、稀释、4℃平衡、液氮熏蒸和液氮冻存后精子的活率和活力,质膜和顶体完整性,以及氧化损伤和线粒体功能等,探讨各步骤对精液质量的影响,以筛选猪精液冷冻损伤的关键环节。结果表明:（1）随着精液冷冻进程,精子的活率、活力、质膜完整性和顶体完整性呈现下降趋势。与鲜精对照组相比,4℃处理组、液氮熏蒸处理组和液氮冻存处理组的上述指标均极显著降低（P＜0.01）,说明精液质量在4℃平衡后就已经开始下降;（2）4℃处理组、液氮熏蒸处理组和液氮冻存处理组精子的ROS含量和线粒体通透性转换孔（Mitochondrial permeability transition pore,MPTP）的开放程度极显著高于鲜精对照组（P＜0.01）,这三个处理组的超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）含量和线粒体膜电位极显著低于鲜精对照组（P＜0.01）,而三个处理组的这些检测指标之间无显著差异（P＞0.05）;与4℃平衡处理组对比,液氮熏蒸处理组精子的活率和活力极显著地下降（P＜0.01）,MPTP开放程度极显著增加（P＜0.01）,质膜完整性显著降低（P＜0.05）。因此,4℃平衡、液氮熏蒸和液氮冷冻操作会导致精液质量下降,其中,4℃平衡和液氮熏蒸是精液冷冻过程中的损伤关键环节。试验二猪精液冷冻保存方案的优化基于试验一筛选出的猪精液冷冻损伤关键环节,本试验在4℃平衡前向精液稀释液中添加经匀浆处理的卵黄、壳聚糖（0 mg/m L、0.05 mg/m L、0.1 mg/m L、0.15 mg/m L、0.2 mg/m L或0.25 mg/m L）与蜂蜜（0%、2.5%、5%或10%）,通过检测解冻后精子的活率、活力、质膜和顶体的完整性,分析氧化损伤和线粒体功能指标,以优化猪精液冷冻保存方案,减少低温和氧化损伤,提高冻精的质量。结果表明:（1）与未匀浆卵黄对照组相比,经匀浆处理的卵黄能极显著地提高解冻后精子的活率、活力、质膜完整性和顶体完整性（P＜0.01）,显著增加线粒体的膜电位（P＜0.05）,但对精液的ROS、SOD和丙二醛（Malonaldehyde,MDA）含量以及MPTP开放程度差异不显著（P＞0.05）,因此,卵黄的匀浆处理能提高精子膜的稳定性,进而提高冻精的质量,后续试验中采用匀浆卵黄替代未处理卵黄添加至冷冻液中;（2）与0 mg/m L壳聚糖对照组相比,0.1 mg/m L壳聚糖处理组能显著提高解冻后精子的活率（P＜0.01）、活力（P＜0.05）和质膜完整率（P＜0.05）,降低线粒体的膜电位（P＜0.01）、ROS的含量（P＜0.05）和MPTP的开放程度（P＜0.05）;此外,0.15 mg/m L壳聚糖处理组解冻后精子的MDA含量极显著低于0.1 mg/m L壳聚糖处理组（P＜0.01）。因此,添加0.1 mg/m L和0.15 mg/m L的壳聚糖能提升解冻后精子的质量;（3）与0%蜂蜜对照组相比,猪精液冷冻保存前添加2.5%或5%的蜂蜜能极显著地提升精子的活率、活力、质膜完整率、顶体完整率、SOD含量和线粒体膜电位（P＜0.01）,极显著地降低ROS含量和MPTP的开放程度（P＜0.01）,但2.5%或5%的蜂蜜处理组MDA的含量与0%蜂蜜对照组之间差异不显著（P＞0.05）,其中2.5%蜂蜜IV处理组的质膜完整性与鲜精对照组差异不显著（P＞0.05）。因此,添加蜂蜜能有效改善精子的质量,特别是5%的蜂蜜I和2.5%的蜂蜜II;（4）0.1 mg/m L壳聚糖+2.5%蜂蜜II处理组解冻精子的活率、活力、质膜完整率、顶体完整率、线粒体膜电位和MPTP开放程度极显著高于0.1 mg/m L壳聚糖处理组（P＜0.01）,但两处理组之间ROS、SOD和MDA的含量差异不显著（P＞0.05）;与2.5%蜂蜜II处理组相比,0.1 mg/m L壳聚糖+2.5%蜂蜜II处理组的线粒体膜电位极显著增加（P＜0.01）,MPTP开放程度极显著降低（P＜0.01）;0.1 mg/m L壳聚糖+2.5%蜂蜜II处理组的活率、活力、质膜完整率和顶体完整率高于2.5%蜂蜜II处理组,但两处理组之间差异不显著（P＞0.05）。因此,宜于在冻存液中添加匀浆卵黄、0.1 mg/m L壳聚糖和2.5%蜂蜜进行猪精液的冷冻保存。试验三猪冷冻保存精液体外受精能力的鉴定为鉴定猪冷冻保存精液体外受精的能力,本试验采集猪的卵母细胞,经体外成熟培养后,采用试验二组合方案所得冷冻保存精液进行体外受精,通过检测其卵裂率和囊胚发育率鉴定其受精能力。结果表明:猪卵母细胞的成熟率为67.41%,其受精后的卵裂率和囊胚发育率分别为50.65%和31.17%。表明采用匀浆卵黄、0.1 mg/m L壳聚糖和2.5%蜂蜜II冷冻保存的猪精液具有良好的体外受精能力。结论:4℃平衡和液氮熏蒸是猪精液冷冻保存处理中精子质量下降的关键环节;在4℃平衡操作前单独添加匀浆卵黄、壳聚糖和蜂蜜能显著增加冻精的质量;匀浆卵黄、0.1 mg/m L壳聚糖和2.5%蜂蜜II组合使用能进一步提升猪冻精的质量,且具备良好的体外受精能力。