研究背景与目的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染可以导致急/慢性肝炎、肝硬化及肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的发生，这些疾病都严重威胁着全人类的健康。全世界范围内大约有3.5亿人为慢性乙型肝炎患者，我国HBV感染者也接近1.2亿。HBV感染的免疫学机制研究一直以来受到研究者的密切关注，近些年，HBV相关的表观遗传学致病机制的研究也逐渐成为研究的热点。为了支持自身的复制和存活，HBV感染宿主细胞后改变了宿主基因的表达，而且促进了肝细胞的损伤。但是，这种潜在的作用机制仍然没有完全被了解释清楚。有研究提示组蛋白H3的第4位赖氨酸三甲基化（trimethylated histone H3lysine4，H3K4me3）修饰与基因活化相关，而组蛋白H3的第27位赖氨酸三甲基化（trimethylated histone H3lysine27，H3K27me3）修饰与基因沉默相关。因此，我们将从表观遗传学的角度出发，以HepG2.2.15和HepG2细胞为细胞模型，通过染色质免疫共沉淀-高通量测序(chromatin immunoprecipitation-sequencing，ChIP-Seq)方法，研究H3K4me3和H3K27me3修饰在HBV诱导相关致病基因表达改变中的作用机制，对HBV诱导肝细胞表观遗传学改变后导致疾病发生、发展的相关机制进行阐述，为乙型肝炎新的治疗策略提供理论依据。实验方法按相应的要求培养HepG2.2.15和HepG2细胞，通过RNA-测序（RNA-sequencing，RNA-Seq）和ChIP-Seq技术分别获得两种细胞的数字基因表达谱（digital geneexpression profiling，DGE）及相应的组蛋白甲基化修饰谱。通过生物信息学的分析可获得HBV相关的差异基因表达谱。依据文献提供的基因功能，挑选特异性的疾病相关差异表达基因按基因的功能进行分类分析。分别收集相应的临床肝活检组织，包括未治疗的慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）病人31例，已经用替比夫定治疗(600mg每天，口服)两年的8例，HBV病毒阴性的7例(作为健康人对照（health control，HC）)。按相应的要求培养HepG2.2.15、HepG2及HepG2.2.15-T(经替比夫定处理)细胞作为实验的细胞模型。通过实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerasechain reaction， QPCR)技术分别检测细胞和肝组织中HBV共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）的表达水平。利用QPCR及染色质免疫共沉淀-实时定量聚合酶链反应（chromatin immunoprecipitation-quantitative real timepolymerase chain reaction，ChIP-QPCR）技术分别从细胞水平和组织水平，对HBV相关疾病基因的表达情况和组蛋白甲基化修饰情况进行检测验证。对检测的数据进行相关性统计分析。利用GraphPad Prism software4.0软件对相关的数据进行统计分析，通过双侧T检验分析两种细胞中的信使RNA（message RNA，mRNA）的表达差异和组蛋白甲基化差异，当P值≤0.05认为有差异有显著性统计学意义。实验结果(1)首先我们通过RNA-测序技术分别获得HepG2.2.15和HepG2两种细胞的数字基因表达谱。发现HBV可以引起宿主细胞大量基因表达的改变，这些基因中一些表现为表达上调，另外一些表现为表达下调。(2)我们通过ChIP-Seq技术分别获得HepG2.2.15和HepG2两种细胞的组蛋白甲基化修饰谱。发现HBV可以引起宿主细胞大量基因座的组蛋白甲基化修饰改变，而且HBV诱导的组蛋白甲基化修饰改变与宿主基因表达改变之间有密切的相关性。(3)通过对HepG2.2.15和HepG2两种细胞的数字基因表达谱进一步分析获得了HBV相关的差异基因表达谱，这些差异表达基因（differentially expressed gene，DEG）中许多与HBV相关疾病有着密切的关系。提示了HBV改变宿主基因表达的改变在它的致病中起到了作用。(4)我们选取代表性的差异表达基因，按基因的功能进行了分类分析。发现这些差异表达基因中许多基因与HBV进入宿主细胞、宿主细胞的炎症、肝脏纤维化和成瘤性都有着密切的关系，提示HBV可能通过改变相关致病基因的表达而导致疾病的发生。我们的研究中还发现，用抗HBV药物替比夫定处理HepG2.2.15细胞后可以将H3K4me3的修饰水平充分地修复到HepG2未经HBV转导时的修饰水平。同样的，我们在临床肝活检组织（健康人对照和慢性乙型肝炎患者）中也得到了相同的结果，替比夫定在显著抑制HBV复制的同时，很大程度上修复了这些重要基因的组蛋白甲基化修饰，尤其是H3K4me3的修饰水平。提示替比夫定对HBV感染患者的治疗作用可能是通过表观遗传学机制来实现的。(5)在研究中我们还发现，HepG2细胞无论在有没有HBV存在的情况下，特异性组蛋白甲基化转移酶SMYD3和EZH2的表达水平并没有明显的差异。提示HBV诱导宿主基因的组蛋白甲基化修饰水平的改变并不是通过调节组蛋白甲基化转移酶的表达来实现的。结论从我们的研究数据中可以发现HBV可以引起宿主细胞大量基因座的组蛋白甲基化修饰的改变，而且这些基因的表达水平也发生了相应的改变，在这些基因基中有许多基因与HBV进入宿主细胞、宿主细胞的炎症、肝脏纤维化和成瘤性都有着密切的关系。有趣的是，在我们的研究中发现用抗HBV药物替比夫定处理HepG2.2.15细胞后，可以将H3K4me3的修饰水平充分地修复到HepG2未经HBV转导时的修饰水平。更重要的是，我们在临床肝活检组织（健康人对照和慢性乙型肝炎）中也发现，替比夫定不仅纠正了HBV相关靶基因的表达，而且在很大程度上修复了这些重要基因的H3K4me3修饰水平。另外，HepG2细胞无论在有没有HBV存在的情况下，特异性组蛋白甲基化转移酶SMYD3和EZH2的表达水平并没有明显的差异。因此，我们的研究数据表明，HBV感染肝细胞后可以诱导宿主细胞发生异常的组蛋白修饰改变，随之疾病相关基因的表达水平也发生了改变，这些改变可能很大程度上参与了HBV诱导肝癌的形成，而且替比夫定在很大程度上可以使这些改变得到逆转。因此，从表观遗传学角度可以说明，替比夫定的治疗可能对HBV相关的慢性感染、肝纤维化和肝癌病人是有益的。