【摘 要】
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目的二苯甲酮类卤酚化合物2,4’,5’-三羟基-5,2’-二溴二苯甲酮（LM49）,对H9c2细胞缺氧复氧（Hypoxia/reoxygenation,H/R）损伤和大鼠心肌缺血再灌注损伤具有显著保护活性,然而其作用靶点仍不清楚。本课题将基于LM49的结构,设计合成小分子探针,使用基于活性的蛋白富集技术（Activity-Based Protein Profiling,ABPP）对LM49直接作用
【基金项目】
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重大新药创制国家科技重大专项（2018ZX09711001-001-017）； 山西省重点研发计划（重点）项目（201703D111033）； 山西省自然科学基金资助项目（201901D111209）； 基于炎性反应的重大疾病创新药物山西省重点实验室2021年度开放课题（2021sxcxyw06,
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目的二苯甲酮类卤酚化合物2,4’,5’-三羟基-5,2’-二溴二苯甲酮（LM49）,对H9c2细胞缺氧复氧（Hypoxia/reoxygenation,H/R）损伤和大鼠心肌缺血再灌注损伤具有显著保护活性,然而其作用靶点仍不清楚。本课题将基于LM49的结构,设计合成小分子探针,使用基于活性的蛋白富集技术（Activity-Based Protein Profiling,ABPP）对LM49直接作用的靶蛋白进行标记、富集和分析。针对潜在靶标角蛋白1（KRT1）,进行结合、信号通路和活性验证,证明LM49通过直接作用于KRT1,影响下游Notch1信号通路,减轻H/R损伤,提高细胞存活率,发挥心肌细胞保护作用。方法:1、设计合成LM49系列分子探针,并采用ESI-MS、~1H-NMR、13C-NMR、~1H,~1H-NOESY、HMBC进行结构确证。2、利用连二亚硫酸钠（Na2S2O4）建立H9c2细胞H/R损伤模型,检测细胞活力和乳酸脱氢酶（LDH）含量,比较探针对H9c2细胞H/R损伤的保护作用。使用LPS诱导RAW264.7细胞产生炎症,检测上清液中NO和TNF-α的释放量,比较探针的抗炎活性。3、探针与细胞共孵育,通过点击化学连接荧光基团罗丹明,对标记的蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳分析,筛选用于富集的探针,优化实验方法。选择探针LM49-P2,通过点击化学连接生物素基团,经亲和素富集靶标蛋白,LC-MS/MS分析鉴定到高置信度靶蛋白KRT1。4、采用分子对接（Autodock）阐明LM49及LM49-P2与KRT1的结合位点和作用模式。通过细胞热转移技术（cellular thermal shift assay,CETSA）和拉下实验（Pulldown）,验证LM49与KRT1的结合作用。H9c2细胞中RNAi敲低KRT1的表达,检测细胞活力和LDH释放量,探讨KRT1在LM49保护H9c2细胞H/R损伤中的作用。通过RT-q PCR检测m RNA水平,分析KRT1在LM49调控Notch1信号通路中的作用。结果:1.设计合成了LM49系列分子探针,其中LM49-P2和LM49-Z2显著抑制了RAW264.7细胞上清液中NO和TNF-α的释放,提高H/R损伤的H9c2细胞相对活力,LM49-P2可有效抑制H/R损伤的H9c2细胞中LDH的释放。2.探针对蛋白的标记实验中,LM49-P1、LM49-P2和LM49-Z2都标记到特异性条带;LM49预孵育可以竞争LM49-P2标记到的特异性蛋白条带;结合活性结果,选择LM49-P2用于后续实验。3.在RAW264.7细胞进行ABPP分析,设置溶剂组、LM49-P2组、LM49竞争组,通过LC-MS/MS分析、富集分析、韦恩分析,获得高置信度靶标蛋白为KRT1。4.分子对接结果说明LM49和LM49-P2可以结合于KRT1的同一位置,且参与形成氢键的分子化合物上的原子基本一致。CETSA结果表明,与对照组相比,LM49处理组KRT1蛋白条带表现出更高的热稳定性。Pulldown结果表明,LM49-P2可以富集到靶蛋白KRT1,而LM49可与LM49-P2竞争性结合靶蛋白,证明KRT1为LM49的特异性结合蛋白。转染KRT1 si RNA后,也表现出对H/R诱导H9c2细胞损伤的保护作用,再给予LM49,LM49没有进一步的保护作用,说明LM49通过抑制该靶点发挥保护作用。进一步,LM49对Notch1信号通路的调控受影响,说明LM49通过KRT1调控Notch1信号通路,减少细胞损伤,提高细胞存活率,发挥细胞保护作用。结论:1.KRT1是LM49直接作用的靶标蛋白。2.LM49通过抑制KRT1蛋白,调控Notch1信号通路,减少细胞损伤,提高细胞存活率,发挥对心肌细胞的保护作用。
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