研究背景:结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)感染引起的目前世界上致病和死亡的主要原因之一，也是危害仅次于艾滋病的全球第二大传染性疾病。近几年来，全球疫情持续回升，每年约有800多万人发病，近200万人死于结核病。结核疫情的持续抬头与当前广泛使用的疫苗——卡介苗BCG的免疫效果的不确定性有着密切的关系，研发新的疫苗成为遏制结核病疫情的迫切需求。抗原表位是抗原分子中的主要功能单位，能有效刺激机体产生细胞免疫和体液免疫，是进行疾病诊断、疫苗研发的关键基础，引起了广泛的科研关注。　　 以前的研究认为宿主对结核杆菌产生的免疫应答中，主要是T细胞所介导的细胞免疫起着重要作用，B细胞和其分泌抗体介导的体液免疫中没有起多大作用。近些年来，随着研究的深入，越来越多的研究结果表明B细胞及其抗体，对T细胞的活化起着重要作用。体液免疫产生的特异性抗体在疾病诊断以及持久的免疫保护中都起着关键的作用。IgM是免疫中机体初次免疫应答时最初产生的抗体，在早期感染中发挥重要的免疫防御作用，具有一定的诊断价值。以前的研究也发现IgM对于分枝杆菌的38-kDa、16-kDa和6-kDa抗原具有很好的特异性。IgM在体液免疫中对B细胞的活化和成熟具有重要作用，而B细胞或单核细胞上表达的Fcα/μR能摄取IgM免疫复合物，并提呈给T细胞，可引起辅助性T细胞的活化。基于IgM抗体在结核免疫中有重要的作用和功能，那么筛选结核分枝杆菌中IgM特异性抗原，有助于发展新疫苗和诊断方法，为进一步的机理研究奠定重要基础。　　 在结核病免疫中，天然免疫主要由巨噬细胞发挥作用。巨噬细胞是人体重要的免疫细胞，能够吞噬入侵的结核分枝杆菌，也是结核分枝杆菌感染的主要对象，为结核分枝杆菌在细胞内的复制和潜伏提供场所。被感染的巨噬细胞通过激活相关的信号途径，诱导巨噬细胞中炎症相关的细胞因子和趋化因子基因转录表达。以前的研究发现结核抗原蛋白可能通过调节宿主的天然免疫产生毒力影响。探讨抗原蛋白对于在结核病免疫中起关键作用的巨噬细胞的影响，可为新的免疫策略的研究打下基础。　　 研究目的:筛选结核分枝杆菌B细胞IgM特异性抗原，对其进行敏感性和特异性检测，寻找新的结核病快速诊断诊断生物标记;深层次探讨其在细胞免疫中的作用，有助于寻找具有免疫保护作用的抗原作为候选疫苗可能，为结核病的新疫苗的研发奠定基础。　　 研究方法:本研究应用商品化的噬菌体随机7肽库，高通量筛选结核分枝杆菌中IgM特异性的抗原表位。筛选中采用多次消减筛选的方法，利用健康人血清去除非特异性的噬菌体，最后获得结核病人IgM特异性噬菌体克隆。运用免疫信息学手段对筛选结果进行B细胞表位的预测分析，挑选具有抗原性较好的抗原进行该抗原基因的克隆表达和蛋白纯化。通过ELISA血清学实验进行免疫原性验证，应用U937细胞系做为体外实验模型，探讨筛选蛋白在天然免疫中的作用。　　 研究结果:　　 1、应用噬菌体展示库技术，采用消减筛选法从结核病患者血清中筛选到了Rv2915c、Rv1960c、Rv3479、Rv2562四个抗原。经过免疫信息学分析，具有符合抗原的特性，具有一定的抗原性。　　 2、成功构建了pNIT-Rv2915c质粒并转入M.smegmatis菌株中进行诱导表达。应用WesternBlot方法首次对Rv2915c进行亚细胞定位，发现Rv2915c蛋白位于细胞壁上，暴露在细胞表面，具有成为免疫抗原的基础。　　 3、成功构建了pET28a(+)-Rv2915c质粒并转入BL21菌株中，进行诱导表达获得重组蛋白。进行血清学验证时发现，抗原Rv2915c对于病人血清，具有一定的敏感性和很好的特异性。　　 4、抗原Rv2915c在天然免疫方面能影响巨噬细胞分泌的重要的细胞因子的表达:引起细胞因子TNF-α、IL-6、IL-12p40的表达升高，而对有利于Th2反应的IL-10的分泌有抑制作用。通过细胞信号抑制剂发现Rv2915c对巨噬细胞刺激可能主要通过ERK和NF-κB通路起作用。　　 结论:应用噬菌体展示库技术结合免疫信息学手段筛选出的四个抗原都展示了出良好的抗原性。挑选出Rv2915c经血清学验证具有一定的敏感性和良好的特异性，也证明这种筛选的方法具有良好的准确性和可行性。筛选出的抗原Rv2915c在天然免疫方面能影响巨噬细胞分泌的细胞因子的表达:引起炎症细胞因子TNF-α、IL-6、IL-12p40的表达升高，抑制抗炎症因子IL-10的分泌的;具有抵抗结核菌的特性。为筛选免疫保护性抗原候选疫苗进行进一步的动物模型实验研究奠定了基础。