果树在生产过程中为达到优质丰产稳产的目的需要进行疏花疏果,而人工疏除法费时费力、化学疏除剂效果不稳定又存在副作用。5-氨基乙酰丙酸(ALA)是生物体内所有有机杂环吡咯化合物的重要合成前体,参与调节植物生长发育,是一种天然无毒可生物降解的环境友好型生物调节剂。本实验室前人研究发现ALA具有疏花的作用,但其机理尚不明确。本文利用光学显微镜、透射电子显微镜、激光共聚焦显微镜、非损伤微测技术(NMT)及定量Real-time PCR等方法初步探讨了 ALA对梨花粉管尖端囊泡积累的影响机制。主要研究结果如下。1.10 mg·L-1、20 mg·L-1、30 mg·L-1的外源ALA处理可以抑制花粉萌发和花粉管伸长,且具有浓度依赖性。在1 min-20 min内随时间的增加对照和ALA处理的花粉管内囊泡的荧光强度都在增强,但前者荧光亮度显著低于后者;与此同时,ALA处理的花粉管囊泡分布紊乱,在尖端以及亚尖端都有分布,失去了对照中顶端分布的特征,这表明ALA可促进囊泡的胞吞作用或抑制胞吐作用。对花粉管伸长过程中尖端Ca2+流速及Ca2+-ATPase相关基因表达量进行检测得出,ALA可以抑制Ca2+的内流速度及上调ACA2和ACA9的表达,且这些作用依赖于胞内较低的Ca2+浓度,表明ALA可以通过抑制Ca2+内流及增加Ca2+外流来减少胞内Ca2+浓度。此外,钙信号还参与了ALA抑制的花粉萌发及扰乱的胞吞胞吐。这些结果表明ALA通过降低Ca2+浓度以促进胞吞作用抑制胞吐作用从而影响花粉管的伸长。另外,通过透射电镜对花粉管尖端超微结构的观察证明了缺钙在ALA破坏内质网、高尔基体及线粒体等细胞器结构的过程中也起重要作用。2.为探究ALA的具体信号通路,我们引入了血红素加氧酶HO1与NO两个在ALA代谢过程中的重要因子。(1)HO1的诱导剂Hemin可抑制花粉萌发及花粉管伸长且具有浓度依赖性,与ALA一样也能造成花粉管尖端囊泡积累及分布变广,而其抑制剂ZnPP使ALA的作用得到缓解,证明了 ALA对花粉的抑制作用依赖于增加HO1活性,且与囊泡积累有关。(2)10 mg·L-1-30 mg·L-1ALA可以不同程度的增加花粉管内NO含量。用0.5 mmol·L-1-3.5 mmol·L-1的NO外源供体SNP处理发现,SNP可以浓度依赖性的抑制花粉萌发及花粉管伸长;加入不同浓度的NO清除剂cPTIO后ALA对花粉的抑制作用得到缓解,其中70 μmol·L-1的cPTIO缓解效果最好,表明ALA可以通过增加细胞内NO含量来抑制花粉萌发过程。FM4-64的染色实验证明ALA对囊泡的积累作用同样也依赖于NO。对HO1、NO及Ca2+进行上下游分析表明HO1在NO上游而NO又在Ca2+上游。3.通过加入微管稳定剂紫杉醇Taxol来探究ALA对囊泡运输过程的影响,结果表明不同浓度Taxol稳定微管结构后ALA的抑制花粉萌发作用得到缓解,其中0.1 mg·L-1浓度效果最好,表明ALA可以破坏微管,造成微管解聚;对囊泡进行染色得到ALA对囊泡的积聚作用同样依赖于其解聚微管抑制的囊泡运输。从分子角度进一步研究ALA对胞吐作用过程中囊泡的拴系及融合的影响,结果表明ALA主要影响了囊泡的拴系过程,它可显著上调梨花粉管中EXO70B1、SEC3A、SEC5A、SEC6、SEC8及SEC15A等基因的表达量,且这种作用依赖于降低胞内Ca2+的浓度,这从侧面证明了 ALA通过降低Ca2+浓度来抑制胞吐作用造成囊泡积累过多分布变广,从而抑制花粉萌发过程。综上所述,ALA抑制花粉萌发过程的具体机制为:ALA通过提高HO1活性增加管内NO含量,又能降低位于NO下游的Ca2+浓度,破坏内质网、高尔基体及线粒体的细胞结构、解聚微管,从而抑制囊泡的胞吐作用促进胞吞作用,造成囊泡积累效应,进而抑制花粉的萌发及花粉管伸长。