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新城疫(ND)和传染性法氏囊病(IBD)是危害养禽业的两大疾病,其死亡率高,能够造成极大的经济损失。疫苗免疫是预防这两种疾病的有效手段。目前疫苗的使用使这两种病得到一定的控制。但是也存在着ND多次免疫仍出现非典型ND现象,IBD也出现强毒株的感染,屡屡导致免疫失败。当前,多表位疫苗是研究热点之一。与传统疫苗相比,其应用性和可操作性极大,表位的联合、修饰或改造在质粒水平上可以及时方便的操作。研究表明,恒定链(invariant chain, Ii)在抗原递呈过程中起重要作用。Ii中与CLIP区N端相连的四个氨基酸序列LRMK称为Ii-key,具有增强免疫应答的作用。Ii-key己被作为免疫载体与抗原表位相连；Ii的其他区域能促进这种免疫增强作用。文章旨在以鼠Ii功能片段作为免疫载体,构建含NDV、IBDV的4组不同串联方式的多表位疫苗,研究多表位苗能否诱导产生针对不同病毒的抗体,及表位串联顺序的不同对免疫原性是否有影响,以期获得最佳的免疫原性。首先,选择了NDV抗原表位F306及IBDV抗原表位VP2与鼠Ii的胞浆区、跨膜区、Ii-key构建串联嵌合体：Cyt/TM/Ii-key/F306、Cyt/TM/Ii-key/F306/VP2、 Cyt/TM/Ii-key/VP2、Cyt/TM/Ii-key/VP2/F306。以实验室原有的质粒pEGFP-Cl-Ii、 pET-32a-F306、pET-32a-VP2为模板,根据设计成功的引物,将扩增出来的目的片段插入原核表达载体pET-32a中。通过质粒双酶切鉴定及质粒测序结果比对,表明构建了正确的重组质粒：pET-32a-Cyt/TM/Ii-key/F306 pET-32a-Cyt/TM/Ii-key/F306/VP2、pET-32a-Cyt/TM/Ii-key/VP2、pET-32a-Cyt/TM/ Ii-key/VP2/F306,同时以构建的pGEX-4T-1-F306、pGEX-4T-1-VP2作为检测抗原。其次,将构建的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta工程菌中,通过优化融合蛋白的表达条件,确定最佳诱导时间为4h,最佳诱导浓度为0.8mmol/L。用此最佳表达方法进行蛋白的大量表达。经改良KCl染色切胶法纯化回收目的蛋白,最后获得分子量约为41.35kDa、43.22kDa.31.56kDa、43.22kDa、37.22kDa、27.43kDa的六组纯化蛋白。采用Folin-酚法检测各融合蛋白的浓度,六组蛋白浓度检测结果：His-Cyt/TM/Ii-key/F306为1.47mg/mL、His-Cyt/TM/Ii-key/F306/VP2为0.91 mg/mL、His-Cyt/TM/Ii-key/VP2为0.78 mg/mL、His-Cyt/TM/Ii-key/VP2/F306为0.96 mg/mL、GST-F306为0.93 mg/mL、GST-VP2为0.85 mg/mL,均达到后续实验的要求。最后,免疫Balb/c小鼠,三免后采血制备多克隆抗体。确定最佳抗原工作浓度为2.0μg/mL,最佳抗体稀释浓度为1：2000。用间接ELISA方法检测血清抗体效价,测得抗体效价在2.1×104至8.6×10‘之间。结果表明：基于免疫载体Cyt/TM/Ii-key的含两个表位的抗原肽His-Cyt/TM/Ii-key/F306/VP2 His-Cyt/TMIi-key/VP2/F306分别与只含单个抗原表位的His-Cyt/TM/Ii-key/F306、 His-Cyt/TM/Ii-key/VP2相比,抗体效价没有降低；经统计学软件分析,两个表位的串联顺序(即表位基因F306、VP2与免疫载体Cyt/TM/Ii-key之间的间隔大小)的不同,其免疫效果差异不显著(P>0.05)。Western Blot分析,各组纯化的融合蛋白具有良好的免疫原性。综上,Cyt/TM/Ii-key作为免疫载体的NDV、IBDV多表位串联疫苗能诱导产生针对不同抗原表位的抗体,而且多表位的串联顺序对免疫效果影响不显著。这为Ii这一新型免疫载体应用于新城疫及法氏囊病的防治提供实验依据。