论文部分内容阅读
小反刍兽疫(Peste des petits ruminants,PPR)是由副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbillivirus)的小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病,主要感染野生动物在内的小反刍动物。宿主感染PPRV后,临床症状主要表现为发热、坏死性口炎、腹泻、支气管肺炎等,死亡率达50%～80%,给畜牧养殖业造成了巨大的经济损失。内质网是细胞内各种蛋白合成、修饰和分泌的主要场所,也是病毒完成自身生命周期的必需场所。病毒在成熟和复制的过程中都需利用宿主细胞的内质网合成大量的病毒蛋白,造成大量未折叠或错误折叠蛋白的累积,从而引起内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS),进而激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)。大多数RNA病毒均能引起内质网应激,而PPRV能否诱导内质网应激未见有研究报道,为了探究PPRV感染宿主细胞后能否诱导内质网应激及内质网应激调控其复制的分子机制,本文主要针对2个方面展开研究,其内容与结果如下:(1)PPRV感染能够诱导山羊子宫内膜上皮细胞(EECs)发生内质网应激。本文通过透射电镜观察EECs内质网的形态结构,发现PPRV(MOI=3)感染后使细胞的内质网腔发生明显的肿胀;EECs感染PPRV后用免疫印迹和q RT-PCR检测发现内质网应激的标志分子GRP78与GRP94在m RNA转录和蛋白的表达水平均明显上升,表明PPRV感染能够诱导EECs发生内质网应激。为了探究PPRV感染诱导内质网应激激活了UPR的哪些信号通路,利用免疫印迹与定量PCR的方法分别对UPR的三条信号通路(PERK、ATF6、IRE1)上的关键因子进行了检测,结果显示PPRV感染EECs后促进PERK与e IF2α蛋白的磷酸化水平和ATF4与CHOP的m RNA的表达水平,表明PERK-e IF2α通路被激活;而ATF6与IRE1通路均未被激活。为了分析各种病毒蛋白对内质网应激的影响,用含有病毒P、C、H、V和N基因的质粒转染宿主细胞后,用Western blot检测发现,HA-C和HA-N蛋白显著诱导了GRP78和GRP94的表达,表明PPRV的C蛋白与N蛋白在诱导EECs内质网应激的过程中发挥重要作用。(2)内质网应激对PPRV复制的影响。为了进一步分析内质网应激和UPR通路在PPRV复制过程中的作用,本文利用TG、4-PBA、GSK2606414以及干扰GRP78、GRP94、PERK的si RNA促进或抑制内质网应激后,对PPRV的病毒滴度以及N蛋白的表达进行了检测。结果表明,内质网应激的诱导剂TG作用24 h时促进PPRV的复制,但在48 h和72 h时抑制PPRV的复制,4-PBA缓解内质网应激后抑制PPRV的复制,表明内质网应激在一定程度上促进PPRV的复制;使用药物GSK或干扰PERK来抑制PERK通路均降低了PPRV的复制。研究还发现,干扰GRP94分子的表达对病毒复制无明显作用,而干扰另一个标志分子GRP78后显著抑制PPRV的复制。综上所述,本研究发现PPRV感染EECs后能够诱导内质网应激的发生,并激活PERK-e IF2α信号通路,C、N蛋白是PPRV诱导EECs内质网应激的关键蛋白;进一步发现内质网应激能够促进PPRV的复制,并且PPRV能够利用PERK通路与GRP78增强其复制。该研究结果为进一步深入探究PPRV致病机制奠定了理论基础。