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研究背景与目的脓毒症(sepsis)是指由感染或可疑感染引起的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS),感染源可以是细菌、真菌、病毒或其他,其进一步发展可导致严重脓毒症、脓毒性休克、MODS甚至死亡。严重脓毒症是指脓毒症合并心血管功能不全或急性呼吸窘迫综合征(ARDS),有2个或2个以上的其他器官功能障碍。脓毒症休克是指严重脓毒症伴有明显外周低灌注,并经积极的液体复苏后循环状态仍不能稳定,血流动力学仍需要血管活性药物才能勉强维持的状态。众所周知,脓毒症引起的死亡主要是由不同的器官衰竭导致的,尤其是心血管功能衰竭。心肌功能障碍在脓毒症和脓毒性休克中很常见。免疫系统激活、心肌线粒体功能障碍、一氧化氮(NO)和过氧硝酸盐等多种机制参与其中。成人脓毒性休克患者中,心肌功能障碍患者的死亡率比非心肌功能障碍患者的死亡率更高,而儿童脓毒性休克患者更有可能发生血管舒缩功能障碍并需要血管加压药物治疗,他们往往对收缩和舒张药治疗都有反应,提示心肌功能障碍在儿童患者中比在成人患者中发挥更重要的作用。脓毒症时心肌线粒体损伤引起氧化应激增加、心肌线粒体形态异常。儿茶酚胺能降低氧化应激水平并改善线粒体呼吸功能。异丙肾上腺素(ISO)是一种典型的合成类儿茶酚胺,结构上类似于内源性儿茶酚胺肾上腺素和去甲肾上腺素,它是一种强烈的非选择性p受体(p1-和β2-AR)激动剂。p1和β2-AR都是G蛋白偶联受体(GPCRs),它们在心血管功能的调控中发挥关键作用。研究表明,除了它的血流动力学作用,ISO可能也通过调节脂多糖(1ipopolysaccharide, LPS)诱导性炎症反应发挥功效,具有抗炎、抗休克功能。然而,ISO对心肌组织的作用,目前研究较少。我们推测ISO可通过降低促炎因子及氧化介质水平、升高抗炎因子及抗氧化介质水平减轻炎症反应,从而减轻心肌损伤。本研究通过观察持续静脉输注不同剂量ISO对脓毒症大鼠血清生化指标、心肌病理改变、线粒体结构和功能、炎症因子和氧化应激因子的影响,探讨ISO对脓毒症大鼠心脏的保护作用及其机制,并找出ISO的适宜剂量。本研究将为ISO在临床上应用于脓毒症的早期保护性治疗提供一定的实验依据。方法1.建立脓毒症模型及分组无特定病原体(Specific pathogen Free, SPF)级SD雄性大鼠30只(中山大学医学实验动物中心提供：动物批号44008500003278),体质量250-300g,行右颈外静脉置管术前禁食12h,自由饮水。1.1建立脓毒症模型实验前24 h,所有实验大鼠行右颈外静脉置管术建立静脉输液和采血通道。术后24 h,予实验大鼠腹腔注射10mg/kg脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)或10mg/kg生理盐水建立脓毒症模型或对照组。1.2动物分组采用简单随机方法,将30只大鼠编号后采用随机数字表法分为5组,每组6只。内毒素组：腹腔注射LPS 10mg/kg同时持续输注生理盐水1ml/h; ISO干预组(低剂量组、中剂量组和高剂量组)腹腔注射LPS 10mg/kg同时持续输注ISO 0.06μg/(kg·min)、0.3μg/(kg·min)和0.6μg/(kg·min);对照组腹腔注射生理盐水10mg/kg同时持续输注与其他组等体积(1ml/h)的生理盐水。1.3 观察终点腹腔注射生理盐水或LPS后24 h。2.检测标本的采集、制备和检测2.1血液标本的采集、制备和检测腹腔注射LPS或盐水后2h、6h通过静脉通道采血1ml并回输等量盐水,于观察终点(腹腔注射LPS或生理盐水后24h)采血4ml。血液标本室温静置1-2 h,3000rpm(离心外径150mm)离心10min分离得到血清,将分离得到的血清分装并放至-80℃冰箱储存待测。运用全自动生化分析仪检测腹腔注射LPS或盐水后24 h大鼠血清的肌酸激酶(CK)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平：运用双抗体夹心酶联免疫吸附分析法(ELISA法)检测腹腔注射LPS或生理盐水后2h、6h和24 h大鼠血清的TNF-α IL-1β和IL-10水平。2.2心肌组织的采集、制备和检测于观察终点(腹腔注射LPS或生理盐水后24 h)用10%(100g/L)水合氯醛麻醉大鼠,打开腹腔,迅速摘取心脏,在预冷的生理盐水中漂洗、去除血液和大血管。取100mg心肌组织,采用差速离心法提取大鼠心肌线粒体,JC-1染色后用流式细胞仪检测心肌线粒体肿胀度和膜电位。取一小块心肌组织(1cm3)切1mm3大小,置于2.5%戊二醛固定、锇酸后固定、脱水、包埋、切片、染色后透射电镜下观察并拍摄照片,观察心肌线粒体超微结构。另取一小块心肌组织用10%甲醛固定,经脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡、苏木素-伊红染色(HE染色)、透明处理封片后,光镜下观察心肌病理改变。剩余组织分装至EP管并投入液氮中,隔日取出存放于-80℃冰箱以备测心肌线粒体氧化应激相关指标。运用比色法检测大鼠心肌线粒体氧化应激相关指标(SOD、iNOS活力及MDA、NO含量)。3、统计学处理所有数据用SPSS 20.0统计软件分析,数据用均数±标准差(x±s)表示。多样本间均数的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA);均数两两比较时,方差齐性者采用LSD法,方差不齐者采用Dunnett T3法。P<0.05为差异有统计学意义。结果1、大鼠24 h血清生化指标(CK和CK-MB)与对照组相比,内毒素组腹腔注射LPS后24 h大鼠血清的CK和CK-MB水平升高(P均<0.05)；ISO干预使CK和CK-MB水平降低(P均<0.05)。2、心肌线粒体氧化应激因子水平2.1 NO含量变化与对照组相比,腹腔注射LPS后24 h内毒素组心肌线粒体NO含量升高(8.300±0.740 & 10.823±2.240, P<0.05)；与内毒素组相比,ISO干预使NO含量降低(P均<0.05)。2.2 iNOS活力变化与对照组相比,腹腔注射LPS后24 h内毒素组心肌线粒体iNOS活力升高(0.031±0.008&0.045±0.008,P<0.05)；与内毒素组相比,低剂量组iNOS活力降低(0.045±0.008&0.033±0.003,P<0.05)；与内毒素组和低剂量组相比,中、高剂量组iNOS活力升高(P均<0.05)。2.3 SOD活力变化与对照组相比,内毒素组腹腔注射LPS后24 h心肌线粒SOD活力降低(11.543±1.080&9.892±±0.815,P<0.05)；与内毒素组相比,ISO干预使SOD活力升高(P均<0.05)；与低剂量组相比,中、高剂量组SOD活力升高(11.822±0.460&19.802±±1.309,11.822±±0.460&19.737±±1.215,P均<0.05)。2.4 MDA含量变化与对照组相比,腹腔注射LPS后24 h内毒素组MDA含量升高(0.950±0.195&1.663±0.618,P<0.05)；与内毒素组相比,低、中剂量组MDA含量降低(1.663±±0.618&0.768±0.312,1.663±0.618&1.203±0.167,P均<0.05)；与低剂量相比,中剂量组MDA含量升高(0.768±0.312&1.203±0.167,P<0.05)；与对照组和低、中剂量组相比,高剂量组MDA含量升高(P均<0.05)。3、线粒体肿胀度和膜电位水平3.1线粒体肿胀度与内毒素组(1.690±0.148)相比,ISO干预使线粒体肿胀度降低(P均<0.05)；与对照组(1.537±0.109)和低剂量组(1.506±0.116)相比,中剂量组肿胀度降低(1.160±0.186)(P均<0.05)；与中剂量组相比,高剂量组肿胀度升高(1.160±0.186&1.393±0.128,P<0.05)。3.2线粒体膜电位与对照组(0.825±0.058)相比,内毒素组(0.190±0.074)、低剂量组(0.175±0.05)、中剂量(0.198±0.086)、高剂量组(0.251±0.10)膜电位降低(P<0.05)。4、线粒体超微结构对照组线粒体大小正常,排列整齐。内毒素组线粒体异常,表现为肿胀、大小不一,出现线粒体嵴断裂、膜融合、空泡变性等改变。低、中剂量组线粒体结构相比内毒素组明显改善,高剂量组线粒体出现肿胀、嵴断裂等异常。5、心肌病理改变(HE染色)对照组心肌排列整齐,未见异常。内毒素组心肌组织疏松水肿,内见淋巴细胞浸润和红细胞渗出,提示炎症反应；低、中剂量组心肌炎症反应较内毒素组减轻；高剂量组见炎症渗出。6、大鼠炎症反应指标6.1 不同时间点(2h、6h和24h)各组大鼠血清TNF-α水平6.1.1 腹腔注射LPS或盐水后2h血清TNF-α水平与对照组相比,内毒素组和ISO处理组(低剂量、中剂量和高剂量组)TNF-α水平显著升高(P均<0.05)；与内毒素组相比,中剂量和高剂量组TNF-α水平显著降低(P均<0.05)；与低剂量组相比,中剂量和高剂量组TNF-α水平显著降低(P均<0.05)。6.1.2 腹腔注射LPS或盐水后6h血清TNF-α水平与对照组相比,内毒素组和ISO处理组(低剂量、中剂量和高剂量组)TNF-α水平显著升高(P<0.05)；与内毒素组相比,中剂量和高剂量组TNF-α水平显著降低(P<0.05)；与低剂量组相比,高剂量组TNF-a水平显著降低(P<0.05)。6.1.3腹腔注射LPS或生理盐水后24 h血清TNF-α水平与对照组相比,内毒素组、低剂量组和中剂量组TNF-α水平显著升高(P<0.05)；与内毒素组相比,高剂量组TNF-a水平显著降低(P<0.05)；与低剂量和中剂量组相比,高剂量组TNF-α水平显著降低(P<0.05)。6.2不同时间点(2h、6h和24h)各组大鼠血清IL-1β水平6.2.1腹腔注射LPS或盐水后2 h血清IL-1β水平与对照组相比,内毒素组和ISO处理组(低剂量、中剂量和高剂量组)IL-1β水平显著升高(P均<0.05)。6.2.2腹腔注射LPS或盐水后6h血清IL-1β水平与对照组相比,内毒素组和ISO处理组(低剂量、中剂量和高剂量组)IL-1β水平显著升高伊均<0.05)。6.2.3腹腔注射LPS或盐水后24 h血清IL-1β水平与对照组相比,内毒素组和ISO处理组(低剂量、中剂量和高剂量组)IL-1β水平显著升高(P<0.05)。6.3不同时间点(2h、6h和24h)各组大鼠血清IL-10水平6.3.1腹腔注射LPS或盐水后2h血清IL-10水平对照组IL-10水平未检测到。与低剂量组相比,高剂量组IL-10水平显著降低(P<0.05)。6.3.2 腹腔注射LPS或盐水后6h血清IL-10水平对照组IL-10水平未检测到。与内毒素组相比,低剂量组IL-10水平显著升高(P<0.05)；与低剂量组相比,中剂量组IL-10水平显著降低(P<0.05)。6.3.3 腹腔注射LPS或盐水后24 h血清IL-10水平对照组IL-10水平未检测到。与内毒素组相比,低剂量组IL-10水平显著升高(P<0.05),高剂量组IL-10水平显著降低(P<0.05)；与低剂量组相比,中剂量组和高剂量组IL-10水平显著降低(P<0.05)。结论1、脓毒症早期大鼠心肌和心肌线粒体受损；2、持续低剂量[0.06μg/(kg·min)] ISO输注对心肌和心肌线粒体具有保护作用,其机制可能与降低氧化／氮化应激水平、升高抗氧化／氮化应激水平和减轻炎症反应有关。