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目的 探讨bcl-2和bax在NO诱导人肝癌细胞凋亡中的作用。 方法 用RT-PCR方法检测NO诱导的肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721凋亡中bcl-2和bax mRNA表达水平的动态变化;非定向克隆构建携带反义bcl-2和bax cDNA片段的真核表达载体;脂质体介导的基因转染法将重组质粒转染HepG2细胞,并用RT-PCR和Immuno-blot的方法鉴定克隆细胞株;用MTT、荧光染色技术、流式细胞术定性和定量检测SNP对克隆细胞生长增殖的影响。 结果 1、1.0mmol/L SNP能降低肝癌细胞HepG2和SMMC-7721的bcl-2、bax mRNA的表达水平,提高bax/bcl-2 mRNA的比值并呈时间依赖性。但HepG2细胞bcl-2和bax mRNA降低的幅度较SMMC-7721细胞小,开始变化的时间也较SMMC-7721细胞迟。2.RT-PCR和基因拼接的方法扩增出bax和bcl-2基因片段,分别构建了携带反义bax和bel-2基因片段的重组质粒pcDNA3.1/Hygro(-)bax和pcDNA3.1/Hygro(-)bcl-2。双酶切鉴定产物大小与预期值相符合,序列测定分析进一步表明所克隆的基因为bax和bel-2的基因片段。3.将重组质粒转染肝癌细胞HepG2,RT-PCR在克隆的细胞株内扩增出潮霉素B的抗性基因,Immuno-blot方法检测出克隆细胞株bax和bel-2蛋白的表达水平较HepG2细胞明显降低。4.4株肝癌细胞株生长增殖速度不同:HepG2-bax最快,HepG2-bel-2细胞最慢,而HepG2-pcDNA3.1和HepG2的相似。5.SNp能抑制HepG2、HepG2-bel-2、HepG2-bax和HepG2-pcDNA3.1的生长增殖,并诱导其凋亡,但敏感性不同:HepG2-bel-2对SNP作用的敏感性最高;HepG-2-bax最低;而HepG2-pcDNA3.1与HepG2相似。结论1、SNP诱导肝癌细胞株的凋亡可能与其bel一2、bax mRNA表达水平的变化,导致bax/bcl一2 mRNA比值的上升有关。2、成功构建了携带反义bax和be卜2 cDNA片段的重组质粒PcDNA3.1/H yg泊。bax和PeDNA3 .1册ygro(一)bel一2。3、成功克隆了bax和bcl一2低表达的肝癌细胞株HepGZ一bax和Hepq一bel一2。4、be卜2抑制而bax促进NO诱导的肝癌细胞凋亡。 总之,本研究结果表明bcl一2和bax在NO诱导的肝癌细胞凋亡中起重要的调节作用。